内容提要
炎症性肠病（IBD）的发病率，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，随着时间的增加，并显示出年轻的趋势。近年来，IBD的精确诊断和有效的治疗引起了越来越多的关注。然而，诊断和定位炎性病变仍然是IBD面临的一个巨大挑战。在本研究中，在一种聚集诱导发射（AIE）纳米探针（BPN-BBTD纳米颗粒[NPs]）的辅助下，第二个近红外（NIR-II）荧光成像首次用于准确追踪炎症病变、监测炎症严重程度和检测IBD小鼠模型对药物干预的反应。NIR-II荧光成像引导下的手术具有高信号背景比（SBR）和NIR-II区域生物成像的清晰空间分辨率等优点，有助于实现严重炎症碗的完全切除和安全的手术吻合。此外，借助NIR-II荧光广域显微镜，可以直接在组织水平上检测到BPN-BBTD NPs的分布，发现其主要聚集在粘膜和粘膜下层。
结果和讨论
BPN-BBTD NPs的表征
在我们之前的工作中，我们合成了一种具有强NIR-II发射的AIE荧光探针BPNBBTD，并用于血管和肿瘤的成像。在该分子中，使用BPN（N，N-二苯基萘-1-胺)作为供体，而使用BBTD(苯并[1,2-c：4,5-c‘]双[1,2,5]-噻二唑）作为受体。供体-受体结构赋予BPN-BBTD分子较强的NIR-II荧光性质，NIR-II荧光量子产率为1.8%。我们进一步将BPN-BBTD与多个电子F127封装到NPs中，用于进一步的生物医学应用。分别通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）测量了BPNBBTD NPs的结构和尺寸。这些NPs的平均直径为≈53.14nm。Zeta电位分析显示，NPs在水中的Zeta电位值为−0.16±1.20 mV，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中为−0.34 ± 1.87 mV。通过监测NPs在水、PBS和等离子体中的荧光强度，进一步分析了BPN-BBTD NPs的稳定性。荧光强度的变化可以忽略不计。通过监测NPs在水、PBS和等离子体中的荧光强度，进一步分析了BPN-BBTD NPs的稳定性。在3天内，荧光强度的变化可以忽略不计。我们还通过5天的DLS分析分析了水中和PBS中NPs的大小变化，没有发现明显的变化。NPs的吸收光谱和发射光谱分别如图所示。吸收峰在≈值为710nm处，发射峰在≈值为930nm处。我们还评估了BPN-BBTD NPs的光稳定性。经过1h的连续793 nm激光照射，功率密度为1W厘米−2，bpnbbtdNPs显示只有微不足道的荧光损失，而ICG显示巨大的荧光强度的损失，这表明优秀的光稳定性BPN-BBTD NPs。为了评估BPN-BBTD NPs对肠细胞的细胞毒性，我们选择了一个结肠癌细胞系（CT-26）进行体外试验。在NPs浓度高达100 μg mL−1时，未检测到明显的细胞毒性。因为我们的NPs也可以有效地激发793纳米激光和组织自身荧光辐射793纳米激光辐射低于辐射690纳米激光，因此我们选择了一个793纳米激光进一步实验即使我们的NPs的吸收在690纳米波长。
不同IBD模型的NIR-II荧光成像
为了探讨BPN-BBTD NPs是否能观察到IBD的病变，我们选择了3个化学诱导的小鼠模型进行验证，包括dss诱导的、TNBS诱导的结肠炎模型和恶唑酮诱导的结肠炎模型。对于DSsincesed结肠炎模型，DSS组小鼠喂食含5% DSS的水7天，其余3天改用正常水。对照组小鼠用正常饮水喂养了整整10天。所有小鼠在第9天静脉注射200L 1mgmL−1 BPN-BBTD NPs，并在第10天获得NIR-II荧光。炎性病变可以在体内直接观察到。为了检测NIR-II荧光信号是否从病变肠段特异性发出，我们收集了两组患者的整个肠道并用于NIR-II荧光成像。我们发现对照组和结肠炎组小肠NIR-II荧光信号可忽略不计。在结肠段，结肠炎组的荧光信号明显强于对照组。结果与dss诱导的结肠炎的病理特征相一致，病变病变集中在结肠。有趣的是，结肠的NIR-II荧光信号呈节段性分布，而不是均匀分布，这与人类IBD的病理特征相似。由于NIR-II生物窗口的高SBR和清晰的空间分辨率，结肠可以精确地识别炎性病变。我们通过在两个微小的炎症病变上画一条线来进一步评估成像质量，然后进行高斯拟合。所选炎症性病变的直径分别为1.20和0.56mm。为了证实BPN-BBTD NPs不能在正常结肠中积累，我们将NPs注射到对照组小鼠中，用于NIR-II荧光成像。DSS组的结肠长度较短，NIR-II荧光信号较强。.然后，我们切开DSS组的结肠，清除粪便。结果表明，NIR-II荧光信号主要来自结肠壁，两组粪便中NIR-II荧光均可忽略不计。H&E染色显示DSS组的炎症细胞浸润和溃疡形成多于对照组。对于TNBS诱导的模型，TNBS组小鼠在小鼠肩膀之间的区域用1% TNBS致敏7天，第8天将2.5% TNBS溶液注入结肠腔内。对照组用溶剂处理。第8天，所有小鼠均通过尾静脉注射200L 1mgmL−1 BPN-BBTD NPs。在TNBS诱导的模型中也检测到类似的结果，NPs在TNBS组小鼠的结肠中积累。TNBS组结肠的NIR-II荧光信号明显强于对照组。切开TNBS组的结肠后，荧光信号也主要来自结肠壁，而不是来自粪便。然而，TNBS诱导模型的粪便荧光强度略高于dssincesed诱导模型。我们推测这种现象的原因可能是结肠注射时的机械损伤。根据H&E染色，TNBS组的炎症和出血比对照组更明显。对于恶唑酮诱导的结肠炎，我们也观察到模型组结肠的高NIR-II荧光强度。然而，与dss诱导和TNBS诱导的结肠炎模型不同，恶唑酮诱导的结肠炎模型的粪便释放出强烈的NIRII荧光信号，尽管结肠壁的炎症强度也相对较高支持信息粪便信号可影响对结肠炎性病变的观察。
通过NIR-II荧光强度监测病变结肠的炎症程度
考虑到粪便中的NIR-II荧光可以忽略不计，我们选择了dss诱导的小鼠模型进行进一步研究。除了准确的诊断外，疾病严重程度的分类对于评估疾病进展和预测预后也至关重要。为了检验BPN-BBTD NPs辅助的NIR-II荧光强度是否与疾病的严重程度相关，我们使用不同的DSS浓度分别为0、2.5%和5%，建立了不同严重程度的DSS诱导小鼠模型。流程图如图所示。简单地说，小鼠随机分为三组，喂食含有不同剂量DSS的水7天。然后，将含dss的水转换为正常水3天。第9天，三组小鼠均静脉注射BPN-BBTD NPs，24h后使用InGaAs相机（1100长通滤光片）观察。在建模期间，每天记录体重和疾病活动度指数（DAI）的数据。我们发现体重减轻在第8天出现了明显的差异，而DAI从第6天开始出现了显著的差异。进一步收集三组患者的结肠，并用于NIR-II荧光成像。随着DSS浓度的增加，结肠的长度变短。0%、2.5%和5%dss诱导结肠炎组的结肠平均长度分别为9.3、8.3和6.4cm。采用ImageJ软件定量分析了NIR-II的荧光强度。随着长度从0% DSS组减小到5% DSS组，荧光强度逐渐增加。皮尔逊相关分析用于评估结肠长度与荧光强度之间的相关性。荧光强度与结肠长度呈显著负相关（p < 0.0001，R2 = 0.9153）。在对照组中可以观察到非常微弱的NIR-II荧光信号。这可能与结肠壁血管中残留的NPs有关。验证炎症水平在动物模型与不同的DSS浓度，病理部分的结肠组织和演示的结构破坏和浸润炎症细胞是严重5% DSS组，中等2.5% DSS组，对照组可以忽略不计。
使用BPN-BBTD NPs评估IBD小鼠模型对药物干预的反应
在临床实践中，非甾体抗炎药（NSAID）药物，例如5-氨基水杨酸（5-ASA），通常用于诱导和维持IBD患者的缓解状态。为了研究该方法是否能重新影响对药物干预的反应，我们检测了不同IBD组的NIR-II荧光强度与5-ASA干预之间的关系。将小鼠随机分为两组，分别喂食5% DSS水7天，然后改用正常水3天。药物干预组小鼠前7天口服200L含5-ASA溶液（100mgkg−1）溶液，对照组给予相同体积的水。每天也记录体重和DAIs的数据。我们找到了重量与5-ASA组相比，对照组小鼠的小鼠数量明显减少，DAIs明显升高。第10天，处死所有小鼠，收集小鼠结肠进行NIR-II荧光成像。5-ASA组的平均结肠长度明显长于对照组，而荧光强度则较低。结肠的长度与NIR-II信号强度呈明显的负相关（p < 0.0001，R2 = 0.9330）。药物干预组在病理切片上炎症和细胞浸润较轻。最后，我们验证了两组间炎症水平在分子水平上的差异。Western blot检测四种炎症相关或凋亡相关蛋白。与对照组相比，5-ASA组的STAT-3蛋白和NF-B蛋白的表达水平较低，而ZO-1和Bcl-2蛋白的表达水平较高。Western blot结果显示5-ASA组炎症水平较低，黏膜破坏较少。
NIR-II荧光成像引导下严重炎症肠段切除术
当IBD炎症加重时，患者病情逐渐恶化，如出血、结肠穿孔、脓肿等。手术被认为是治疗的补充，以预防并发症，提高IBD患者的生活质量。如我们之前所述，BPN-BBTD NPs可以帮助在IBD模型中精确定位病变的肠段。为了在组织层面上证实这一发现，我们从同一只IBD小鼠中解剖了荧光可忽略的结肠段和荧光较强的结肠段，并进一步对切片进行H&E染色。H&E染色结果显示，NIR-II荧光较强的片段出现，炎症细胞浸润更严重。基于这一发现，我们可以对IBD手术进行NIRII荧光图像引导下的手术，以实现严重炎症性肠的完全切除和安全的手术吻合。
炎症性肠切除术的整个过程见图。首先，我们借助NIR-II荧光成像系统定位具有强NIRII荧光的病变。一个具有强NIR-II荧光信号的结肠部分被鉴定为严重病变的结肠节段。第二，无菌地去除选定的具有强NIR-II荧光的结肠段。在去除选定的结肠段后，我们发现保存的结肠的NIR-II荧光信号非常弱。然后将其余肠段吻合，在前侧和后侧同时缝两针。整个手术过程由InGaAs检测器引导和记录。切除的肠病变经H&E染色，显示严重的炎症细胞浸润和粘膜损伤。准确切除严重炎症性肠并与正常吻合,由于吻合口因吻合口渗漏、吻合口肠狭窄而引起并发症，对患者具有重要意义。因此，提高炎症肠切除的准确性将在一定程度上减少并发症。由于NIR-II荧光成像具有高灵敏度、无创性和自由辐射性，被认为是手术导航的理想技术。此外，NIRII生物窗口的组织自身荧光远低于NIR-I和可见窗口。特别是在肠道手术中，自身荧光不仅产生于组织本身，而且也产生于肠道内容物，这可能会对肠道手术带来更多的干扰。在NIR-II荧光成像引导手术下，外科医生可以通过强信号精确切除肠，选择相对正常的肠进行吻合。
利用NIR-II荧光广域显微镜解读BPN-BBTD NPs在病变肠道的分布
为了解读NPs在病变肠壁中的分布信息，我们利用自制的NIR-II荧光广域显微镜直接观察结肠的组织水平。从dss诱导的小鼠模型中分离出一个具有强荧光信号的肠段，放置在一个覆盖物上，然后翻转，以确保结肠组织吸附在载玻片上。然后，我们将玻璃放在一个金属环状的底座上。操作图和原理图。结肠壁的详细结构大致分为浆膜层、肌层层、粘膜下层和粘膜层以下4层。由于我们的高空间分辨率NIR-II荧光宽视场显微镜，使用电动台清晰地记录了0~350μm不同深度的图像。牺牲小鼠后，血液在毛细血管中凝固，残留的NPs部分也保存在毛细血管中。因此，浆膜层显示了一些毛细血管的荧光信号，我们将首先观察到的荧光信号的切片确定为0 μm切片。随着深度的增加，在60~180μm之间未检测到明显的NIR-II荧光信号。推测在60~180μm深度范围内的组织均为肌层所在层。在结肠壁的四层中，粘膜层和粘膜下层表现出强烈的NIR-II荧光信号，表明这两层中积累了大量的BPN-BBTD NPs。为了更好地揭示粘膜层和粘膜下荧光区域的形态，将两个结肠节段切片进行H&E染色。结合H&E染色和NIR-II荧光成像，我们发现NPs容易聚集在粘液中的炎症细胞周围.
总结
综上所述，我们初步探讨了NIRII荧光成像在BPN-BBTD NPs AIE纳米颗粒在IBD诊断和手术中的应用价值。BPN-BBTD NPs在静脉注射后可有效地聚集在炎症部位，并在793 nm激光照射下发出明亮的NIR-II荧光。利用NIR-II生物窗口成像的深穿透和高SBR的优势，可以可视化和精确地定位炎性病变。通过检测病变结肠的NIR-II荧光强度，我们可以很容易地监测IBD的疾病严重程度和对治疗干预的反应。此外，我们首先展示了NIR-II荧光成像引导下的手术在IBD治疗中的潜力。此外，利用我们自制的NIR-II荧光广域显微镜，我们可以直接观察BPN-BBTD NPs在结肠组织中的分布，而无需将组织切片成切片。对于IBD小鼠模型，NPs主要聚集在粘膜层和粘膜下层。本研究提示了AIE NPs辅助NIR-II荧光成像在IB中的优越性。
参考文献
Aggregation-Induced Emission (AIE) Nanoparticles-Assisted NIR-II Fluorescence Imaging-Guided Diagnosis and Surgery for Inflammatory Bowel Disease (IBD) ，Xiaoxiao Fan, Qiming Xia, Yiyin Zhang, Yirun Li, Zhe Feng, Jing Zhou, Ji Qi,* Ben Zhong Tang,* Jun Qian,* and Hui Lin，Adv. Healthcare Mater. 2021, 10, 2101043，https://doi.org/10.1002/adhm.202101043
