内容提要
开发具有强NIR-II(1000-1700 nm)吸收的共轭小分子(CSM)用于光疗是非常可取的，由于缺乏可靠的设计思路，这是一个巨大的挑战。本研究报告了一种用于光疗的高性能在近红外二区有吸收的共轭小分子，它通过裁剪分子平面来实现。一系列CSM显示，随着噻吩数的增加，吸收扩展到NIR-II区，但过多的噻吩数会导致NIR-IIa(1300-1400 nm)亮度和光热效应的降低。进一步引入末端非共轭烷基链可以提高近红外吸收系数、亮度和光热效应。机理研究将这种整体功能上的增强归因于给体/侧链工程的集体贡献所产生的分子平面性。这一发现指导了NIR-II CSM的设计，通过合理地操纵分子的平面性来高效地执行1064 nm介导性的光疗。
结果与讨论
设计了一系列分子平面度可变的吸收近红外的D-A-D型CSM。其中，(BBTDT，RED)因其具有低禁带宽度和平面结构而被选作电子受体。当与合适的平面供体相结合时，这些性质有利于获得长波长和强吸收光的荧光团。平面型的噻吩基单元既可以作为电子供体，也可以作为π桥，只是简单地增加了共轭骨架的长度，以实现近红外-II的吸收。进一步引入末端非共轭烷基链可以提高它们的分子平面性，获得更好的吸收行为，特别是在NIR-II区域。最后，通过Pd催化的Stille/Suzuki偶联反应，获得了分子荧光团B1T、B2T和B3T(BXT)和B2TA和B3TA(BXTA)，其中X和A分别代表T单元和末端烷基链的数目，产率约为75%。
用密度泛函理论(DFT)方法研究了BXT和BXTA的平面性和电子结构。图1b显示了逐渐减小的二面角，例如中心BBTDT分子与附近T单元之间的蓝色二面角，它显示了随着平面T的增加而更平坦的共轭骨架。末端非共轭A的进一步引入导致了更平坦的结构，这是因为空间位阻的增加抑制了旋转。
其中，B2TA显示出最小的蓝色二面角(30.9°)和最高的整体分子平面度。随着平面度和共轭长度的增加，基色吸收/发射的能隙(ΔE)减小。正如预测的那样，BXT在四氢呋喃中的最大吸收峰(λabs)随着T的增加而发生明显的红移。
侧链的引入对吸收光谱的线形没有明显的影响，但在1064 nm处产生了显著的增强吸收。CSM的显著偏色位移清楚地表明在强极性溶剂中发生了扭曲的分子内电荷转移，这有利于长波长的吸收/发射。
有趣的是，B2TA在四氢呋喃中表现出大的红移λ-abs 853 nm，并在样品中显示最高的吸收1064 nm。这种吸收的改善是因为最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)之间随着平面度和共轭长度的增加而增加的重叠，这促进了电子跃迁，正如Franck-Condon原理所描述的那样。这些理论和实验结果表明，平面结构和共轭长度在近红外II区具有较强捕光能力的有机D-A-D型CSM的发展中起着关键作用。
利用两亲性表面活性剂，通过纳米沉淀法将疏水的D-A-D型近红外吸收CSM制备成水溶性纳米粒子，以考察其生物应用。总结了所得NPs(BXT/BXTA NPs)的光学数据。显示所有纳米粒子在水溶液中表现出良好的分散性和溶解性，平均流体力学直径约为100-140 nm。另一个好处是，NPs内的空间限制效应进一步平坦化了共轭体系，导致在NIR-II区域产生显著的深色吸收/发射。例如，与在THF中的B2T相比，在水中更平坦的B2TA表现出从848 nm到878 nm的吸收红移。此外。在0.59、3.18、3.13、7.38和6.18×103M−1 cm−1处，B1T、B2T、B3T、B2TA和B3ta NPs的计算值分别为0.59、3.18、3.13、7.38和6.18×103M−1 cm−1。值得注意的是，在这些样品中，B2TA纳米粒子的吸收和QY(0.016%)最高，这表明它们在1064 nm激光介导的深部组织近红外光疗中具有巨大的应用价值。
由于我们的纳米粒子在1064 nm处具有很强的捕光能力，我们进一步评估了它们的NIR-II光激发荧光。BXT/BXTA纳米粒子的1064 nm激光激发发射光谱显示，随着T的增加，在NIR-IIa区域有更强的基色发射。虽然这些NPs的荧光强度随着T桥的加入而降低，但末端刚性烷基链的BXTA NPs仍然表现出比BXT NPs更高的荧光强度，主要是因为末端刚性烷基链使结构更加平坦，特别是在具有大空间位阻的聚集态NPs中，这是因为旋转受到抑制。在样品中，B2TA纳米粒子在1300-1400 nm区域显示出最强的NIR-IIa综合发射强度(比B1T纳米粒子增强22.3倍)。B2TA纳米粒子的NIR-IIa强度也显著高于具有相似共轭分子骨架的B2T纳米粒子，这使得它们能够实现高分辨率的NIR-IIa荧光检测。B2TA纳米粒子的这种理想的近红外-IIa光触发的NIRIIa荧光性能可能归因于它们出色的分子平面性，增加了理想的近红外-IIa荧光的最大输出信号。
我们研究了所有纳米粒子的近红外光热性质。在MPE极限功率密度下，经1064 nm激光照射8min后，B1T、B2T、B3T、B2Ta和B3Ta纳米颗粒的溶解温度不断上升，最高温度分别上升到41.7%、58.3%、54.4%、66.3%和64.7%℃。在所研究的NPs中，B2Ta纳米粒子的温度最高，这是因为它们的平面性比对应的NPs更好。在1064 nm激光作用下，B1T、B2T、B3T、B2TA和B3Ta纳米粒子的NIR-IIPCE分别为12.5%、29.5%、28.2%、36.2%和35.8%；这一发现证实了分子平面性对NPs的NIR-II光热性质的重要作用。
我们用飞秒-热分析光谱分析了近红外光热性能优异的根本原因。破译GSB区内的激发态动力学为揭示材料的NIR-II光热效应提供了一种直接的方法。考虑到GSB区域与稳态吸收光谱的重叠，在fs-TA映射中插入的稳态吸收光谱勾勒出GSB区域。以B2T NPs和B2Ta NPs为例，相对于B2T NPs，B2Ta NPs表现出加速的非辐射衰减。此外，在具有激发态吸收(ESA)的B2T纳米粒子中存在长寿命物种。在大约1200 nm处，B2TA NPs中没有这种物种。图所示的FS-TA曲线图验证了这种长寿命物种在B2T NPs中的存在，在大约1200 nm处观察到的高达4.5 ns延迟时间的强烈的ESA信号证明了这一点。在B1T、B3T和B3ta NP的f-TA映射中也出现了类似的现象。
在GSB区域内获得的代表性动力学曲线显示了异常加速的非辐射衰变，这提供了与其他失活通道的显著竞争，以产生出色的NIR-II光热效应。为了排除受激射射区的影响，我们选择了每种材料在远离发射区时的最佳吸收附近的动力学曲线。要获得详细的动态信息，一个令人满意的拟合需要一个三指数模型。为了直观比较，非辐射分量的平均时间常数(τAvg)是通过用它们的相对幅度加权各个分量来计算的。与其他纳米粒子相比，B2TA纳米粒子无与伦比的非辐射衰减率是其优越的近红外-II PCE的决定因素。此外，高达61.5%的B2TA纳米粒子的激发态通过这种超快的非辐射被耗尽。
衰变途径，从而导致B2TA NPs的NIR-II 光热转换效率最高。我们将这种飞秒中间成分的形成归因于一个激发的B2TA通过链间相互作用与附近的基态相互作用，产生优越的NIR-II光热效应。这一假设得到了BXT NPs中没有飞秒成分的支持，因为BXT NPs的末端T单元没有烷基链。此外，当我们将B3ta NPs(6.2ps)与B3T NPs(22.5ps)进行比较时，我们观察到了类似的现象，尽管B3ta NPs中这种短暂的成分存在的时间比B2Ta NPs中的要长得多。通过对结构的仔细研究，我们推断这种独特的飞秒中间组分的形成也与平面结构密切相关，而不是烷基链的唯一贡献。换言之，B2Ta相对于B3Ta更平坦的结构应该是形成B2Ta纳米粒子中飞秒中间组分的关键。这些结果为设计高性能的NIRII光疗试剂提供了新的见解。基于我们到目前为止的发现，我们认为通过进一步平坦化B2TA纳米颗粒可以显著改善其近红外-II光致变色特性。
为了验证我们的假设并改善NIR-II的光疗性能，我们进一步设计了具有增强平面性的β分子，将末端地面附近的T单元替换为EDOT的笨重平面单元。正如预期的那样，这一修改导致了更具有平面结构的Beta，每个单元之间的二面角显著减少(低于10°)。这种平面结构的Beta在所制备的CSM中显示出最低的ΔE(1.03eV)；因此，它在四氢呋喃中也显示出最长的吸收波长λabs(873 nm)。得到的β纳米粒子具有更长的吸收波长是B2TA纳米粒子的3.5倍。这一结果表明，Beta NPs的NIR-II采光能力有所改善。此外，比B2TA NPs高得多的吸收使它们在1064 nm激光激发下显示出比B2TA NPs高1.5倍的NIR-IIa强度。计算出B2TA纳米粒子的近红外-II QY为0.019%，高于B2TA纳米粒子的0.016%。同时，明亮的NIR-IIa图像的Beta NPs的计算的NIR-IIa量子产率(积分NIR-IIa区域)为0.011%，进一步证实了它们在1064 nm激光激发下的理想NIR-IIa闪光能力fS-Ta图证明了存在一个飞秒中间分量，这验证了我们的假设。
此外，很大一部分(90.3%)的βNPs激发群通过超快衰变途径被非辐射耗尽。因此，Beta NPs达到了47.6%的最大NIRII PCE，比B2TA NPs高1.3倍。据我们所知，这种PCE是迄今为止报道的具有近红外-II荧光和NIR-II光热性质的D-A-D型CSM基纳米粒子的最高PCE，并且高于大多数其他类型的报道的1064 nm照射下的光热剂。值得注意的是，由于β-NPs良好的分子平面性所产生的强烈的NIR-II吸收，β-NPs充分利用剩余的~10%的激发态来获得具有NIR-IIa荧光的荧光性质。
图显示了平均流体力学直径为117.8±2.2 nm、低多分散指数为0.117的β纳米粒子的高光稳定性和光热稳定性。与B2Ta纳米粒子相比，1064 nm激光辐照的β纳米粒子产生了更强的光声信号。这些信号与NPs浓度呈良好的线性关系。所有这些发现共同证实，我们设计的Beta NPs是潜在应用于单个1064 nm激光触发的NIR-IIa FLI-、NIR-II PAI-和NIR-II PTT光疗的极佳候选者。
β纳米粒子在1064 nm处的强大捕光能力和改进的NIR-IIa荧光允许1064 nm激光激发高分辨率NIR-IIa FLI和NIR-II PAI。首先，我们分别对1064和808 nm激光激发的腹部血管进行了B2TA和Beta NPs辅助的近红外-IIa荧光成像，以证明在相同的注射剂量下，1064 nm激光触发成像的质量优势。由于在1064 nm激发下，与B2TA NPs相比，Beta NPs具有更高的NIR-IIa荧光，从周围的背景组织中可以清楚地观察到经Beta NPs处理的腹部血管的良好成像。在808 nm激光激发下，用β-NPs辅助的NIR-IIa FLI进行分辨率比较。如图所示，与808 nm激光相比，1064 nm激光激发的血管显示出更好的轮廓和更高的对比度。808 nm激光激发的小鼠血管轮廓模糊，对比度差，这是由于周围背景组织信号较强所致。计算的1064 nm激光触发的腹部血管的SBR高达28.8，成像分辨率为0.42 mm，显著高于808 nm激光的成像结果(SBR=2.5)，这表明β纳米粒子可能用于高对比度成像。在大脑和腿部血管中观察到的类似结果进一步证实了Beta NPs的NIR-IIa FLI能力。
随后，通过静脉注射B2TA纳米粒和β纳米粒到4T1移植瘤小鼠体内进行了NIR-IIa FLI和NIR-II PAI。注射NPs后，肿瘤区域NIR-IIa FLI和NIR-II PAI的信号强度随时间逐渐增强，12h达到峰值。与B2TA NPs处理的小鼠相比，NIR-IIa FLI和NIR-II PAI在各个时间点都显示出更强的信号强度，这表明Beta NPs的NIR-IIa FLI和NIR-II PAI性能增强。在12小时时间点，接受Beta NPs治疗的小鼠的肿瘤NIR-II荧光/光声信号比接受B2TA NPs治疗的小鼠显示出2.3/2.2倍的增强。这一结果证实了β纳米粒显著的肿瘤蓄积和成像能力。注射后24小时，肿瘤区域代谢信号明显减弱，杀死小鼠，然后对分离的主要器官和肿瘤中的信号进行评估，以检查它们的生物分布。体外实验结果显示肝脏、脾和肿瘤中有明显的信号，这有利于随后的体内肿瘤的NIR-II PTT。因此，使用单一NIR-II光源的β-NPs辅助高分辨率成像对于下一代体内肿瘤治疗的精确指导似乎是可行的。
受我们在实验中获得的精确成像的启发，我们进一步在活体内进行了单台1064 nm激光触发的NIR-II PTT。首先，在4T1癌细胞中显示了良好的体外细胞摄取和βNPs的NIR-IIa FLI能力。通过MTT比色法和活体细胞染色实验研究了β纳米粒的体外近红外-II PTT性能。图显示了在黑暗中最小的细胞毒性，即使在高NPs浓度(100μg mL−1)下也是如此。1064 nm激光照射8min后，细胞存活率逐渐下降，并呈剂量依赖性。不出所料，100μg m L−1处理的细胞杀伤率高达92%，这是因为βNPs具有良好的近红外-II型PCE。活死细胞染色实验也使得对Beta NPs体外PTT性能的直观评估成为可能。仅用NPs处理的细胞几乎完全被绿色荧光染色。然而，激光照射后，细胞逐渐被红色荧光染色，表明出现了死亡细胞。特别是由于Beta NPs的NIR-II光热性能增强，经Beta NPs和激光照射处理的细胞被杀死，几乎没有绿色细胞。
接下来，进行了体内NIR-II PTT实验。我们首先验证了我们的纳米粒子在活体小鼠身上的生热能力，方法是在12小时的最佳照射时间下对它们的肿瘤进行1064 nm激光激发的近红外光热成像。图中的热图像和温度曲线清楚地显示，经β-NPs处理的小鼠肿瘤的温度在2分钟内从30.1℃迅速上升到55.2℃，并在连续1064 nm激光照射8分钟后稳定在约62.8℃；这些温度足够高，足以杀死肿瘤组织。PBS和B2TA纳米颗粒治疗的小鼠的肿瘤在激光照射8分钟后仅显示出轻微的温度上升(分别达到40.6℃和49℃)。根据治疗的不同，4T1荷瘤小鼠被分为五组，分别为PBS组、B2TA NPs组、Beta NPs组、B2TA NPs+L组和Beta NPs+L组。对照组(如PBS、B2TA NPs和Beta NPs)的肿瘤体积迅速增大，而1064 nm激光照射8min的治疗组(如B2TA NPs+L和Beta NPs+L)的肿瘤体积显示出明显的生长抑制。
结论
我们提出了一种基于分子平面性的简单而清晰的策略来开发用于高性能NIR-II激发光疗的D-A-D型近红外吸收CSM基纳米颗粒。体积较大的平面EDOT单元和端烷基侧链的共同引入显著改善了其分子平面性。因此，Beta纳米粒子表现出高的NIR-II吸收强度，导致NIR-IIa荧光增强，从而使NIR-IIa FLI具有出色的SBR(28.8)。FS-TA光谱显示有一飞秒中间成分，这显著加速了非辐射过程，增强了NIR-II光热效应，具有良好的NIR-II光热效应(47.6%)。最后，我们设计的测试型纳米粒子被成功地应用于1064 nm激光触发的NIR-IIa FLI/NIR-II PAI导引的NIR-II PTT。本研究为高性能NIR-II激发光热像仪的创新开发提供了指导。
参考文献
Increasing Molecular Planarity through Donor/Side-Chain Engineering for Improved NIR-IIa Fluorescence Imaging and NIR-II Photothermal Therapy under 1064 nm. Chen, S., Pan, Y., Chen, K., Chen, P., Shen, Q., Sun, P., Hu, W., Fan, Q. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202215372. https://doi.org/10.1002/anie.202215372
