内容摘要
具有最小毒性和副作用的显像剂的肾脏可清除方面对于临床转化是必不可少的，然而临床上具有及时肾脏清除途径的近红外I/II(NIR-I/II)荧光载体非常有限。在这里，我们通过β-乳球蛋白(β-LG)和氯化-菁染料的共价键合，合理地开发了花菁-蛋白质复合策略，以产生明亮和稳定的近红外-I/II荧光团(例如，β-LG@IR-780)。β-LG具有小分子量(18.4 kDa)和超小尺寸(<5 nm)的保护壳作用，从而使β-LG@IR-780具有良好的生物相容性和肾脏排泄能力。我们的β-LG@IR-780探头能够对血管和淋巴引流系统的生理和病理状况进行非侵入性和精确的近红外II可视化，便于术中影像引导手术和术后的非侵入性监测。我们的探针在主要器官中的最小积累提高了整体生物安全性。这项研究为新一代NIR-II荧光团提供了一种简便的方法，并极大地改善了小分子染料的亮度和药代动力学。
结果与讨论
为了构建一种具有明亮的近红外发射和肾脏清晰度的稳定的蛋白质@菁染料，我们选择了一系列功能蛋白质，包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、血红蛋白、转铁蛋白(Tf)、β-乳球蛋白(β-LG)、乳铁蛋白(LF)和α-乳蛋白(α-LA)，以探讨其对IR-780的荧光增强作用。我们选择IR-780是因为它的光稳定性比其他菁类荧光团更好。牛血清白蛋白和白蛋白已被证明与IR-780共价结合形成具有较高近红外亮度的稳定络合物。绘制了系列中蛋白质@IR-780络合物的近红外-II信号随反应温度的变化曲线，结果表明β-LG也表现出显著的荧光增强，特别是在较高的反应温度下。在PBS中，β-LG@IR-780的近红外-II信号比IR-780高12倍，而在二甲基亚砜中，与IR-780相比，亮度保持了近50%。β-LG@IR-780的亮度与BSA@IR-780或HSA@IR-780大致匹配。凝胶电泳实验有效地确定了IR-780与蛋白质的共价结合。我们发现只有BSA@IR-780、HSA@IR-780和β-LG@IR-780在其对应的分子量位置上显示出明亮的荧光带，证实了β-LG与IR-780之间形成了共价键。凝胶电泳法检测IR-780与蛋白质不同比例的探针表明，IR-780只能与等摩尔蛋白质共价结合。
我们进一步用高分辨质谱仪研究了IR-780与β-LG之间的结合细节，证明每个β-LG分子只能共价结合一个IR-780。为了确定IR-780和β-LG的结合位置，将L-半胱氨酸分子与IR-780作为封闭剂反应，并用基质辅助激光分辨飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)证实了结果。L-半胱氨酸的硫醇基团可以通过亲核取代选择性地与中氯取代碳反应。电泳结果表明，半胱氨酸封闭的IR-780不能与β-LG反应。综上所述，结果证实IR-780首先通过超分子相互作用插入到β-LG的花盏状疏水空腔中。随后，β-LG的游离型半胱氨酸与IR-780的Cl-C基团可能形成了共价环，通过亲核取代反应稳定了口袋中含氯的染料。因此，这种两步反应产生了超高亮度和稳定的β-LG@IR-780探针。
由于传统近红外菁染料固有的近红外-II荧光尾部发射，β-LG@IR-780探头显示了相当高的近红外-II亮度。值得注意的是，改进的TICT工艺优先固定了IR-780的构象；因此，β-LG@IR-780的近红外-II信号可以达到1400 nm。通过在填充了β-LG@IR-780的毛细血管上覆盖不同厚度的脂肪内脂(1%)来确定在近红外-I或亚近红外-II窗口成像时的成像渗透率。绘制每组厚度的信号分布表明，在NIR-II窗口成像优于NIR-I窗口。
在确认IR-780与β-LG共价结合后，下一步的目标是通过近红外光谱亮度和电泳法确定最佳反应条件(反应温度、反应比和反应时间)。结果表明：(1)反应温度高于70℃时，可实现充分的共价结合和荧光增强；(2)反应比超过1：1时，可得到无结合的游离染料；(3)反应时间可优化至>2 h，以获得稳定的探针。同时，优化的β-LG@IR-780探针的近红外-II量子产率(QYs)是高压CO(HiPCO)转化单壁碳纳米管(HiPCO-SWCNTs)的36.2%，大大优于临床上可用的ICG(4.3×HiPCO-SWCNTs)。我们进一步研究了β-LG与其他典型菁染料的荧光增强和结合行为，包括ICG、IR-783、IR-808等。结果表明，β-LG只与含氯染料共价键合，白度显著提高，尤其是β-LG@IR-780的白度提高了11.4倍。这些结果与图S2中的高分辨MS数据一致，充分证实了β-LG只能与含氯的菁染料共价结合。反应体系的浓度控制在20 μM以下以避免不可逆的荧光猝灭效应，而从较高的反应浓度合成的β-LG@IR-780即使在相同的稀释度下也无法恢复预期的亮度。此外，β-LG@IR-780的亮度与反应浓度的拟合表明，只有在低于10 μM的反应浓度下才能观察到线性关系，这促使我们进一步优化10 μM以下的反应浓度以获得最大亮度的探针。在实际应用中，我们制备了β-LG@IR-780，最佳反应浓度为10 μM，然后用超滤浓缩体系。这种方法有效地防止了在高反应浓度下固有的荧光猝灭。正如预期的那样，β-LG@IR-780的NIR-II亮度在将浓缩样品稀释到其原始浓度后将完全恢复。
考虑到潜在的临床应用，我们通过检测β-LG@IR-780探针的血液安全性并与临床使用的ICG进行比较，重点研究了β-LG@IR-780的生物毒性和排泄能力。结果证明，β-LG@IR-780即使在很高的浓度(600 μM)下也表现出可以忽略不计的溶血作用。同时，对于LO2肝癌和4T1乳腺癌细胞，与IR-780相比，β-LG@IR-780即使在高达200μΜ的孵育浓度下也没有明显的细胞毒性。为了进一步评估β-LG@IR-780的体内生物毒性，我们将该探针静脉注射到小鼠体内(单次或多次)，并在注射后1d和14d对主要器官进行生化分析和病理分析。所有生化指标均在正常值范围内，HE染色未见明显的急/慢性损伤和/或炎性病变。总的来说，β-LG@IR-780具有极佳的生物安全性，可在NIR-I/II窗口中进行活体成像。
筛选的β-LG@IR-780具有较低的分子量(∼18.4 kDa)和小分子尺寸(<5 nm)，预计将具有及时的肾脏排泄能力。与我们的预期一致，静脉注射β-LG@IR-780后的BALB/c小鼠的近红外生物成像显示肾脏清除良好。测定注射后4h小鼠静脉血中β-LG@IR-780的含量(P.I.)，时间点也表明血浆清除速度很快。相比之下，给予游离IR-780和BSA@IR-780的队列显示，肝脏立即蓄积，随后通过肝胆排泄途径从体内长期排泄。IR-780和BSA@IR-780的其他缺点包括明显的皮肤摄取和主要器官的严重蓄积。此外，还显示了IR-780在含有BSA或β-LG的溶液中的近红外-II全身成像和器官分布。通过比较，可以观察到它们在单独使用IR-780和BSA@IR-780时表现出一致的代谢行为(肝胆代谢)和皮肤摄取，这与肾脏可清除的β-LG@IR-780完全不同。这一现象充分表明，β-LG能够通过形成稳定的荧光团来调节IR-780的药代动力学。此外，β-LG@IR-780在尾静脉注射后迅速渗透到肾脏(∼2s)，并连续转移到膀胱(∼3min)。绘制和定量肾/肝抗P.I.。时间点显示，∼95%的累积探针在120h内从体内排泄。β-LG@IR-780在30min、24、120、336h的组织分布。时间点显示的结果与体内统计数据一致。同时收集30分钟、24小时和120小时的尿液。并使用紫外线吸收和荧光强度对信号进行了定量分析。总的来，β-LG@IR-780荧光团在肾脏的快速排泄具有巨大的临床转化潜力。
近红外II生物成像的广泛研究是为了可靠的血管可视化，既可以监测血管生成，也可以评估血管功能。超高亮度β-LG@IR-780探头具有足够的生物安全性和肾脏清晰度，可以在体内进行实时和非侵入性的近红外II血管成像。尾静脉注射β-LG@IR-780后，在>1100 nm成像窗口下收集的图像为小鼠脑和后肢提供了无创血管图像。清晰地显示了脑和后肢的线性横断面荧光强度。值得注意的是，β-LG@IR-780提供了高空间分辨率的血管成像，可区分动脉和静脉。区分动脉/静脉和微血管，并同时跟踪它们的长期生物学功能，对于无创治疗和导航手术都是至关重要的。
我们进一步评估了β-LG@IR-780在近红外-I和各种亚近红外-II窗口下对大脑和后肢血管成像的成像质量/对比度。感兴趣区的血管肌肉比(ROI)值从NIR-I窗的1.2增加到>1300 nm窗的4.6。随后，比较相同注射剂量的β-LG@IR-780和ICG在连续激光照射下超过20min的血管成像质量。β-LG@IR-780的近红外-II成像窗口比ICG长。此外，β-LG@IR-780NIR-II全身成像非常清楚地勾勒出血管网络，特别是在短时间窗口内。同时，对于血管造影，与肝胆代谢的β-LG@IR-780相比，BSA-LG@IR-780探针的皮肤摄取率显著降低，清除速度更快。尾静脉注射β-LG@IR-780 3h后，小鼠后肢的近红外-II荧光信号几乎完全消失。快速的肾脏清除非常适合于疾病模型的长期/多次监测，因此在成像过程中不会因皮肤摄取而引起信号干扰，也不会因长期滞留而引起生理变化。正如预期的那样，β-LG@IR780可以在没有信号干扰的情况下实现对血管的多次/长期监测。总的来说，设计的β-LG@IR-780探头具有良好的尺寸和令人印象深刻的近红外-II成像能力，为目前的近红外导引术中操作提供了补充。
为了研究β-LG@IR-780是否能有效地监测淋巴系统，包括淋巴结和淋巴网络，我们将β-LG@IR-780皮内注射到剃毛的Balb/c小鼠的足垫中。然后，在注射部位施加轻柔的压力1min，以加快向淋巴系统的迁移速度。NIR-II成像显示，可以清楚地检测到骶窝淋巴结，然后在NIR II荧光引导下进行有效的切除。我们还对前肢和尾根注射部位的淋巴结进行了NIR-II成像，并成功地显示了副腋窝和腹股沟淋巴结。值得注意的是，β-LG@IR780探头可以准确地勾勒出肿瘤引流的淋巴结，并且在持续的手术灯暴露下，可以进一步在近红外成像引导下切除淋巴结。在不改变手术装置外观的情况下成像ROI(例如，不需要切换手术室光和激发光)对于将开放手术的术中成像系统集成到当前的临床环境中是必不可少的。
目前，大多数研究使用放射性示踪剂进行淋巴系统的标测；我们的β-LG@IR-780可以提供术中淋巴系统成像的替代方法。为此，皮内注射了β-LG@IR-780，立即从主要注射部位通过三条主要淋巴管(LV)迁移到窝窝LN，得到了∼5.0 LV/肌肉比，特征非常明显(LV的FWHM为∼158.3μm)。在1000~1300 nm的亚近红外窗口采集信号，进一步提高了淋巴系统的成像对比度。此外，通过将ICG和β-LG@IR-780皮内注射到小鼠的足垫，然后在连续的激光照射下成像，评估了持久成像的能力。值得注意的是，β-LG@IR-780的淋巴信号比ICG更稳定，骶窝淋巴结的信号-肌比都更高。通过在选定的时间点收集图像而不是连续的激光照射，β-LG@IR-780在给药后70分钟获得了清晰的淋巴结成像。非常有趣的是，通过在脚上轻轻按压注射部位并储存多余的β-LG@IR-780，可以重复显示淋巴结，为长期/复查成像事件提供了一种有希望的策略。同时，β-LG@IR-780探头即使在肌肉注射时也显示出良好的肾脏排泄能力。可以实现对淋巴系统的多次/长期监测，而不会因长期滞留而造成信号干扰和生理损害。
为了便于实际应用，通过结扎昆明(KM)小鼠后肢的主要LV，建立了阻断淋巴引流的淋巴水肿模型。随后，在术后第三天，将β-LG@IR-780注射到KM小鼠的双后肢足垫皮内，以监测是否发生继发性淋巴水肿。β-LG@IR-780衍生的近红外II成像技术可以清楚地检测到水肿的发生。一旦发生水肿，人体会自发产生大量新的LV来调节体液平衡，导致淋巴系统侧肢的循环开放，进而导致活体显像剂运动路径的显著变化。注射β-LG@IR-780可以清楚地标示出具有明显信号肌肉比的延窝淋巴结、骶骨淋巴结、腹股沟淋巴结和辅助腋窝淋巴结。同时，错综复杂的新淋巴管也清晰可见。综上所述，上述结果验证了β-LG@IR-780用于近红外II淋巴造影术的优越性，提供了通过活体成像全面了解淋巴引流图并定量评估淋巴传输和功能的能力。
结论
综上所述，我们通过β-乳球蛋白(β-LG)和氯菁染料(IR-780)的共价键开发了一种通用和高效的替代品。合成的探针解决了当前使用的NIR-II荧光团的主要器官中的有限亮度或长期保留的问题。我们的结果揭示了蛋白质和菁染料之间的相互作用机制，这是以前在白蛋白体系中专门研究的。β-LG包裹IR-780形成β-LG@IR-780探针，具有更高的生物相容性和良好的肾脏清除率(∼95%清除率)。在近红外窗口中，β-LG@IR-780可以无创、清晰地显示血管和淋巴引流系统，远远优于临床上用于术中成像和成像引导手术的ICG。值得注意的是，β-LG@IR-780可以用来监测术后继发性淋巴水肿的状态，这是手术后癌症患者常规护理所需的。鉴于这些有希望的特点，可以预见，这一简单而有效的蛋白质@染料复合策略将提供一个宝贵的机会，通过明亮和快速的肾脏清除来丰富现有的NIR-II荧光团资料库。在过去的几十年里，由于荧光引导手术(FGS)已经为患者带来了好处，带有高性能造影剂的NIR-II FGS将以更高的穿透深度、更好的时空分辨率和更少的操作光干扰来显著改善目前的FGS结果。在临床前评估和临床试验方面，必须进行70项精心设计的研究，以促进其进一步临床应用。
参考文献
Ultrabright Renal-Clearable Cyanine-Protein Nanoprobes for High-Quality NIR-II Angiography and Lymphography. Jiajun Xu, Tianyang Han, Yajun Wang, Feiran Zhang, Mengfei Li, Lang Bai, Xinyu Wang, Bin Sun, Xin Wang, Jianshi Du, Kun Liu, Junhu Zhang, and Shoujun Zhu*. Nano Lett. 2022, 22, 19, 7965–7975. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.2c03311
