内容提要
NAD(P)H对生物合成反应和抗氧化功能至关重要。然而，目前用于体内检测NAD(P)H的探针需要瘤内注射，这限制了它们在动物成像中的应用。为了解决这个问题，作者开发了一种脂溶性阳离子探针KC8，它在与NAD(P)H反应后表现出优异的肿瘤靶向能力和近红外(NIR)荧光。利用KC8首次证实了活结直肠癌(CRC)细胞线粒体中NAD(P)H的水平与p53的异常高度相关。此外，KC8不仅可以成功地用于区分肿瘤和正常组织，而且可以在静脉注射时区分p53异常的肿瘤和正常肿瘤。最后，作者通过两个荧光通道评估5-Fu治疗肿瘤后的肿瘤异质性。本研究为实时监测结直肠癌细胞p53异常提供了新的工具。
结果与讨论
首先，采用常规合成步骤(方案S1)制备探针2和3，然后进行光学实验以评估其光谱响应。结果表明，对喹啉进行对取代的化合物2无光谱响应，而化合物3有明显的响应，在735 nm处有近红外发射。然而，作者发现化合物3的渗透性有限，这阻碍了它检测内源性NAD(P)H的能力，这与之前的报道一致。为了解决这个问题，羧基被提议转化为相应的酯，这将增强探针的渗透性，使其能够被困在细胞中。因此，作者制备了化合物4，并对其检测内源性NAD(P)H的能力进行了测试，结果表明化合物4确实能够检测内源性NAD(P)H，且具有浓度和时间依赖性。不幸的是，化合物4与NAD(P)H的反应缓慢，NAD(P)H处理4小时后荧光强度趋于稳定。受Chang的工作启发，将化合物3中的羧酸与硼酸酯相连。制备的KC8(1)对NAD(P)H具有快速、高敏感的反应，是一个有吸引力的候选物。
通过紫外/可见吸收和荧光光谱分析考察了KC8检测NADH的能力。结果表明，NADH分别在725 nm和550 nm处诱导了显著的吸光度增强和降低。此外，相应的荧光强度在745 nm的PBS中增加了6倍以上。为了评价KC8对NADH的选择性，作者测试了KC8对各种阴离子、阳离子、氨基酸和酶的反应。如图S5a所示，除了NAD(P)H外，这些物质都不能诱导荧光开启响应。
作者还考察了不同pH值下添加NADH的影响。结果表明，KC8在酸性和碱性溶液中几乎没有荧光发射。此外，在中性溶液中检测反应增强，因此在后续实验中选择pH 7.4作为测量体系。动力学研究表明反应在1小时内完成，明显快于与化合物4的反应。荧光强度与NADH浓度呈线性关系。根据IUPAC定义(CDL=3 Sb/m)， KC8对NADH的检出限为0.4 μmol，胞浆中NADPH浓度为3.1±0.3 μmol, Hela细胞线粒体中NADPH浓度为37±2 μmol。
在进行成像检测之前，KC8在Hela细胞中的细胞毒性使用磺胺B (SRB)检测进行评估。结果显示，不同浓度的KC8 (0-50 μM)处理Hela细胞5和10小时后，细胞活力均较高，说明KC8对活细胞的毒性较低。为了进一步评估其对CRC细胞的毒性，作者将HCT-116、HCT-116 p53−/−、HT-29和正常细胞NCM-460用不同浓度的KC8 (0-50 μM)培养72小时。结果表明，KC8在10 μmol时对HCT-116、HCT-116 p53−/−、HT-29细胞具有极低的毒性，而对正常细胞系NCM-460具有中等毒性。随后，作者进行了共定位实验来研究KC8在细胞中参与NAD(P)H氧化还原反应的位置。结果表明，KC8选择性定位于线粒体，皮尔逊系数约为0.88。
通过对正常细胞(NCM-460)和结直肠癌细胞(HCT-116)的实验，进一步探讨了KC8区分癌细胞和非癌细胞NAD(P)H水平的能力。结果表明，HCT-116的NAD(P)H水平比NCM-460高出近3倍。这一发现超过了肿瘤与正常(T/N)比值的可接受临床阈值2.0.，因此，结果表明KC8具有根据其NAD(P)H水平区分癌细胞和非癌细胞的潜力。
为了进一步验证以NAD(P)H水平标记肿瘤的可行性，作者探索了使用KC8进行肿瘤特异性荧光成像的体内实验。Hela细胞移植小鼠静脉注射化合物KC8，肿瘤部位的荧光强度在离红色通道40分钟处达到峰值，并在肿瘤中持续1小时以上，与最初的假设KC8可以在肿瘤区域积累一致。然后处死小鼠，相应的荧光图像清晰地标记出肿瘤。除肝脏外，其他器官的荧光相对较弱，这可能与肝脏中KC8的代谢有关。因此，KC8可用于高对比区分肿瘤NAD(P)H水平与其他器官。
PPP是NAD(P)H的主要来源，据报道，在各种癌症中，通过增加进入PPP氧化分支的葡萄糖通量，NAD(P)H显著增加。因此，NAD(P)H水平被认为在添加葡萄糖后升高。用葡萄糖处理Hela细胞，然后加入KC8。结果表明，荧光强度确实显著增强。为了研究通过PPP途径调节NAD(P)H稳态的主要因素，作者评估了该途径中所报道的调节剂对NAD(P)H水平的影响。值得注意的是，作者发现p53激动剂(Kevetrin盐酸盐)和p53抑制剂(Pifithrin -α氢溴酸盐，Pif-α)显著调节线粒体中NAD(P)H水平。进一步研究发现，Kevetrin盐酸盐能显著降低NAD(P)H水平，且呈浓度依赖性，而Pif-α能提高NAD(P)H水平，且呈浓度依赖性，这些结果提示线粒体中NAD(P)H水平与p53蛋白活性密切相关。
先前的研究表明，活细胞中NAD(P)H的水平是由p53蛋白通过与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)结合而调节的。然而，在细胞处理过程中，线粒体中NAD(P)H水平的波动阻碍了对p53蛋白调节过程中NAD(P)H水平的精确监测。此外，作者发现G6PD抑制剂RRX-001和阿司匹林对NAD(P)H水平的影响不显著且不具有浓度依赖性，这表明p53蛋白可能通过G6PD以外的多种途径影响NAD(P)H水平。这些观察结果表明，p53蛋白可能通过几种机制调节活细胞中的NAD(P)H水平。
为了进一步证明NAD(P)H水平与p53活性之间的关系，作者检测了p53敲除细胞系(HCT-116 p53−/−)和突变细胞系(HT-29)的NAD(P)H水平。结果显示，与HCT-116细胞相比，突变细胞和敲除细胞线粒体的荧光强度显著增加。荧光强度的增加提示p53异常的结直肠癌细胞中NAD(P)H水平升高，进一步支持p53与NAD(P)H水平之间的关系。
在细胞检测中使用KC8不仅可以有效区分肿瘤和正常组织，还可以区分p53异常的CRC细胞和正常的CRC细胞。为了研究HCT-116和HCT-116 p53−/−细胞在体内是否可以区分，分别将它们移植到小鼠的左侧和右侧，然后静脉注射KC8。结果表明，KC8在肿瘤中逐渐积累，并与NAD(P)H发生反应。有趣的是，移植了HCT116 p53−/−的肿瘤的荧光强度明显高于HCT-116，这与之前在细胞测定中获得的结果一致。这些发现表明，KC8有可能在不需要从小鼠中提取组织的情况下实时识别p53异常的CRC细胞。
肿瘤异质性是癌症的一个共同特征，可导致不同的细胞集合，对治疗的敏感性程度不同，因此准确评估肿瘤异质性对于开发有效的治疗方法至关重要。由于p53是人类癌症中最常见的遗传异常，作者试图确定HCT-116和HCT116 p53−/−细胞的比例是否可以通过两个通道监测，以响应抗癌药物治疗。HCT-116细胞已被证明对5-Fu敏感，而HCT-116 p53 - / -细胞对5-Fu治疗有抗性。将HCT-116-GFP和HCT-116 p53 - / -细胞的混合物移植到小鼠体内，然后静脉注射KC8和每天腹腔注射5-Fu。每日监测GFP通道和红色通道。器官解剖荧光分析显示，KC8在4天后仍存在于肿瘤中，这可能是由于KC8在肝脏中的主要代谢以及5-Fu对肝脏的毒性，最终，结果显示绿色通道的强度逐渐降低，而红色通道的强度稳步增加，表明5-Fu处理后HCT116相对于HCT-116的p53−/−比值增加。
结论
在本研究中，由喹啉、苯并吡啶和硼酸酯组成了一种新型探针，命名为KC8。这种脂溶性双阳离子结构的KC8表现出显著的肿瘤靶向能力。该探针能选择性检测活细胞线粒体中NAD(P)H，具有高信背景比和近红外发射。值得注意的是，本研究建立了CRC活细胞线粒体NAD(P)H水平与p53异常之间的强相关性，这在之前没有报道过。此外，利用KC8靶向肿瘤区域，将CRC细胞与正常结肠细胞、p53异常的CRC细胞与正常CRC细胞区分开来。重要的是，用5-Fu治疗含有HCT-116和HCT-116 p53−/−的肿瘤后，通过两个荧光通道评估肿瘤的异质性。该研究在CRC细胞中p53功能的实时监测方面取得了重大进展，并为临床环境中的个体化癌症治疗提供了巨大潜力。
参考文献
An Activatable NIR Fluorescent Probe for NAD(P)H and Its Application to the Real-Time Monitoring of p53 Abnormalities In Vivo. Kaiqing Ma , He Yang, Xingkang Wu, Fangjun Huo, Fangqin Cheng,* and Caixia Yin*. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202301518. https://doi.org/10.1002/anie.202301518
