内容提要
药物性肾衰竭(DIRF)是一种严重的医学并发症，死亡率高。然而，DIRF的早期诊断或预后仍然具有挑战性，因为目前的方法依赖于检测晚期生物标志物。在这里，作者提出了一个两性离子单分子半氰胺(ZCs)库，可用于构建可激活的探针来检测DIRF的初始阶段。这些探针的两性离子特性是通过将烷基磺酸盐和季铵阳离子分散整合到半氰酸盐骨架上实现的，这导致创纪录的低血浆蛋白结合(< 5%)和显着的肾脏清除效率(≈96%)。通过用一个能被caspase-8(细胞凋亡的起始指标)特异性切割的四肽来掩盖最佳的候选ZC6，作者进一步开发了一个可激活的探针ZCRR。在顺铂诱导的DIRF小鼠中，系统给药的ZCRR在肾脏中有效积累，并对升高的caspase-8的近红外荧光信号“开启”做出反应，能够比临床方法提前60小时灵敏地检测肾内凋亡，并精确评估不同药物对DIRF小鼠的细胞凋亡修复作用。由于它是尿排泄的，ZCRR也允许远程检测DIRF，并通过体外光学尿液分析预测肾脏保护效果。因此，本研究提出了单分子肾脏可清除支架，适用于开发用于肾脏疾病管理的多功能可激活探针。
结果与讨论
肾可清除单分子半菁氨酸的分子设计
为了获得较高的肾脏清除效率，作者通过引入磺酸盐或羧酸基团来赋予负电荷，引入季铵盐阳离子(quats)来赋予正电荷，从而使半靛碱支架具有两性离子特性，与母体阳离子半靛碱染料相比，具有更好的亲水性。这种独特的正负电荷穿插分布显著影响其肾脏清除率。这些两性离子半菁氨酸通过以下三个主要步骤合成:（i)吲哚类3-5，8-9和15-16的合成；(ii)醛20和21的合成；和(iii)亲核吲哚类和醛的缩合。简要地说，吲哚类化合物的合成从工业原料苯肼和4-肼基苯磺酸开始;得到的吲哚2和7被转化为相应的吲哚种类(3-5和8-9)，每个吲哚都具有相应的烷基链。获得吲哚磺酸13的不同合成路线。在叔丁酸钾的存在下，2-甲基-3-氧丁酸乙酯(10)与1,4-丁烷磺酮烷基化，然后将中间的磺烷基衍生物(11)水解和脱羧，得到5-甲基-6-氧庚烷-1-磺酸(12)。得到的酮12与4-肼苯磺酸反应得到吲哚磺酸13，与碘化甲酯或3-溴丙基三甲基溴化铵分别转化为吲哚15和吲哚16。在β-卤烯醛和2-羟基-4-甲氧基苯甲醛或2-羟基-4-硝基苯甲醛存在下，分别通过级联oxa-Michael加成和脱水得到醛20和醛21。这些醛与上述吲哚类缩合得到相应的带电半菁。为便于比较，还采用上述方法合成了带电但非两性离子的半菁氨酸AC和半菁氨酸CC。
测量了半菁氨酸的光物理性质。在PBS溶液中，所有合成的带电半氰基CMe分别在≈700 nm和≈720 nm处出现吸收和发射峰，与母体半氰基CMe相同。在PBS和FBS缓冲液中测定的荧光量子产率均为≈10%，超过了临床可用的染料ICG(在PBS和FBS中分别为2.7%和9.1%)。32、33光学参数汇总于表S1。
高肾清除率半菁素的筛选
研究了这些带电半花青素在活体小鼠中的生物分布。由于它们本质上是荧光的，因此在静脉注射后60分钟使用NIRF成像来跟踪它们的分布。给药和开腹后，ZC4-6和CC的NIRF信号主要出现在肾脏和膀胱，其他器官未见明显摄取。相比之下，ZC1-3和AC呈肝脏定向蓄积，在肾脏或膀胱的分布极少。ZC4-6和CC在小鼠体内的肾肝信号比分别为2.6、2.7、3.1和2.1，是AC和ZC1-3的4 ~ 25倍(分别为0.41、0.12、0.13和0.53)，说明ZC4-6和CC通过肾脏排泄的效率要高于AC和ZC1-3。体内NIRF成像和离体生物分布研究进一步证实了这些发现。为评价清除率，采用高效液相色谱法对活体小鼠静脉注射后尿液中的荧光团进行定量分析。ZC4-6在注射后24 h的RCEs分别为注射剂量(ID)的90±6.1%、95.8±2.8%和96.1±2.4%，超过了报道的CyO-PEG(≈55%)、CyO-PVP(≈63%)、cyo -葡聚糖(≈78%)和CyO-HPβCD(≈93%)。相比之下，AC、CC和ZC1-3的RCEs要低得多，分别仅为14.5±1.9%、35.1±1.6%、14.2±10%、10±6.9%和20±6%。为了揭示两性离子半菁碱在肾脏中的清除途径，作者测定了三组活小鼠的血浆清除率，分别给予生理盐水、丙戊酸或西咪替丁150 mg kg - 1，然后静脉注射ZC6。Probenecid和西咪替丁是已知的有机阴离子转运体(OAT)抑制剂和有机阳离子转运体(OCT)抑制剂，分别具有阻断小管分泌和重吸收的抑制作用。三组血浆清除率的变化趋势相似，表明ZC6完全通过肾小球滤过而不是肾小管的分泌和重吸收被清除。此外，注射ZC4-6小鼠的主要器官未发现明显的凋亡或坏死迹象，表明这些两性离子半菁具有良好的生物相容性。
为了阐明控制其肾脏清除特性的机制，作者研究了与疏水性和静电相互作用相关的关键物理化学特性，包括分布系数(log D值)、血浆蛋白结合(PPB)比率和这些半菁氨酸的正/负电荷数。计算出pH 7.4时AC、ZC1-6和CC的log D值分别为0.26、4.15、3.75、3.30、0.12、- 0.31、- 0.81和- 1.24，表明所有带电的半菁氨酸都是亲水的。其中，AC、CC和ZC4-6的log D值均低于ZC1-3，说明骨架上增加磺酸盐或烷基铵离子基团的总数可显著增强骨架的亲水性。测定ZC4-6的PPB比值分别为≈4.1%、≈5.0%和≈5.0%，显著低于AC、CC和ZC1-3(16 - 30%)。重要的是，ZC1-6的PPB比率被证明与它们在活小鼠中的rce呈负相关，这意味着增加对蛋白质吸附的抵抗力应该促进肾脏清除。此外，ZC1-3、AC、CC和ZC4-6上的正电荷数和负电荷数分别为1/1、1/2、2/1和2/2，与它们的RCEs呈正相关，说明它们的正电荷数和负电荷数直接影响药代动力学。这可能是由于亲水性较强的两性离子染料(ZC4-6)对蛋白质结合具有很强的抵抗力，而亲水性较差的ZC1-3则不能，而不平衡的阴离子染料(AC)优先结合碱性白蛋白和脂蛋白，阳离子染料(CC)更容易结合酸性的α -1酸性糖蛋白。综上所述，ZC4-6的高rce应该归因于多方面的因素:它们的低分子量远低于胶粒过滤截止值(<50 kDa)，以及报道的高亲水性和平衡的分子电荷分布的共同作用，这些共同作用导致了离子溶剂化的强水化效应。这种强大的水合作用使蛋白质能够抵抗吸附并提高其稳定性，这可能进一步阻止单核吞噬细胞系统的隔离和肝胆清除，而反过来有利于肾脏清除。
ZCRR的合成及体外表征
通过酰胺缩合反应将ZC6的苯胺部分与IETD肽笼化，构建可活化探针ZCRR。采用标准的9-氟酰甲基氧羰基(Fmoc)固相肽合成(SPPS)法合成了IETD。1H NMR和质谱证实了中间体和ZCRR的化学结构。在Casp8缺失的情况下，ZCRR在≈670 nm处吸收最大，几乎无荧光，因为芳香胺基的供电子能力被抑制，导致分子内电荷转移(ICT)受阻。在Casp8存在的情况下，ZCRR在700 nm处表现出约10倍的荧光增强，量子产率为13%。计算出Casp8对ZCRR的催化效率(Kcat/Km)为1.46 μM−1 S−1。此外，ZCRR对其他酶(GGT和Casp3)、活性氧(盐酸、过氧化氢和超氧阴离子)或金属离子(Cu2+、Fe2+和Mg2+)的荧光响应可以忽略，这表明ZCRR对Casp8具有很高的特异性。
研究了ZCRR在培养细胞中检测Casp8的能力。ZCRR本身在高达60 μM的浓度下也表现出良好的细胞相容性。为了诱导细胞凋亡，将HK2细胞(近端小管细胞系)用200 μM浓度的顺铂(一种抗肿瘤药物)处理，36，而对照细胞用PBS处理。在顺铂或PBS处理后3、6、12小时，将ZCRR加入HK2细胞中孵育2小时，然后进行共聚焦荧光成像。在处理后3 h，顺铂处理的HK2细胞胞质中明显观察到ZCRR的NIRF信号，比对照细胞高4倍。激活ZCRR的NIRF信号在顺铂治疗后6 h和12 h进一步增强，分别达到对照细胞的6倍和9倍，表明在顺铂诱导的细胞凋亡过程中Casp8水平逐渐升高。
值得注意的是，在顺铂治疗前6小时，在caspase抑制剂zad -fmk (Vad)保护的HK2细胞中，活化的ZCRR发出的NIRF信号下降到基础水平。通过顺铂与ZCRR共孵育后的细胞上清的HPLC和质谱分析进一步证实了ZCRR在培养细胞中的活化作用，显示出一个新的HPLC峰，保留时间≈12 min，质量重与未孵育的产物ZC6相同。
肾脏清除率和体内稳定性研究
通过高效液相色谱法分析ZCRR静脉注射后的血药浓度，研究ZCRR在活体小鼠体内的药动学。注射后2 h ZCRR血药浓度接近0% ID。根据血浆清除动力学的双室拟合计算其消除半衰期(t1/2β)为≈33 min，表明其在活体小鼠体内的消除速度很快。通过高效液相色谱法测定该探针在活体小鼠静脉注射24 h后总尿中的RCE，测定其为92±2.0%的ID，与未封固的荧光团ZC6相同。说明ZC6中加入亲水性四肽IETD对其RCE没有影响。为了研究尿恢复24 h后小鼠体内残留的ZCRR。收集粪便样本和主要器官，PBS匀浆，提取ZCRR并定量分析。心、肝、脾、肺、肾等主要脏器的ID≈7%，粪便的ID < 1%。
研究了ZCRR及其未笼养衍生物ZC6在健康小鼠体内的生物分布，并与pbs处理小鼠进行了比较。静脉注射ZC6后1 h，肾脏和膀胱内快速检测到NIRF信号，这是因为它具有本质荧光性。然而，ZCRR在所有主要器官中的NIRF信号与对照小鼠一样低，因为ZCRR本质上是非荧光的，Casp8在健康小鼠肾脏中的表达很少。此外，注射小鼠尿液中的ZCRR在光学特性、高效液相色谱和质谱上与在PBS中的纯形式几乎相同，表明ZCRR在活体小鼠中代谢可以忽略不计，具有良好的体内稳定性。此外，苏木精和伊红(H&E)染色显示，ZCRR静脉注射后未造成任何组织损伤，验证了其良好的生物相容性。
实时NIRF成像和DIRF的尿液分析
在顺铂诱导ARF小鼠模型中，评估ZCRR用于实时NIRF成像和DIRF尿液分析的可行性。顺铂在顺铂治疗后的不同时间点(12、24、48和72 h)，以20 mg kg - 1,37的剂量静脉注射顺铂给活小鼠，然后静脉注射ZCRR，而对照小鼠在注射ZCRR之前用PBS治疗。纵向进行全身NIRF成像，实时监测。在顺铂治疗后12 h，注射ZCRR后肾脏内NIRF信号逐渐升高，并在注射后15 min达到最大值，说明顺铂治疗后Casp8升高。同时，用NIRF成像清晰地描绘了活体小鼠的肾脏，显示出比对照小鼠高2倍的信号。由于ZCRR的快速清除，肾信号在较晚的时间点逐渐降低。小鼠在顺铂治疗后24 h和48 h也观察到类似的趋势，肾脏信号进一步增加，分别比对照组高2.7倍和4.5倍，这表明在肾毒性的进展过程中Casp8逐渐升高。在顺铂治疗72 h后，注射ZCRR后15 min的肾脏信号比对照小鼠高5.3倍。有趣的是，注射ZCRR后，肾脏信号在15分钟后仍保持稳定，这应归因于损伤后期肾小球滤过明显减少，导致探针滞留在肾脏中。与此一致的是，离体荧光信号只在肾脏和膀胱中观察到，而没有在其他器官或组织中观察到，这强调了ZCRR在肾脏靶向和Casp8激活方面的特异性。此外，这些小鼠肾脏切片的荧光成像显示，激活的ZCRR的NIRF信号仅在顺铂处理小鼠的肾脏中观察到，而在对照组小鼠中几乎检测不到。这些结果证实了ZCRR能够检测肾小管中Casp8水平的变化。
为了探索ZCRR的转化潜力，研究了其通过尿液分析远程检测DIRF的能力，并与临床可用的肾功能评估方法进行了比较。采用两种量化方法将尿NIRF信号与Casp8水平相关联(i)顺铂治疗和注射zcrr的小鼠尿液的直接NIRF读数，称为在线尿液分析;(ii)收集顺铂处理小鼠的尿液，然后进行ZCRR孵育，然后输出NIRF读数，定义为离线尿液分析。在在线尿液分析中，在顺铂治疗后12小时的样本中观察到第一个具有统计学意义的NIRF增强(2倍)，在治疗后24小时(3.0倍)，48小时(3.6倍)和72小时(4.6倍)继续增加。这一信号趋势与体内成像结果一致，因为尿液中排泄的荧光ZC6是由肾脏中casp8激活ZCRR引起的。高效液相色谱和质谱分析进一步证实了这种活化作用，在保留时间≈12 min时出现峰，与ZC6对应的质量峰相同。离线尿液分析也有类似的趋势。经ZCRR处理的小鼠尿液样本在处理后12、24、48和72 h分别比健康小鼠高1.4倍、1.5倍、2.4倍和2.5倍，具有统计学意义的NIRF增强。免疫印迹分析进一步证实了使用ZCRR尿液分析显示Casp8水平的合理性，证实了顺铂治疗过程中肾脏和尿液中Casp8水平的升高。然而，ELISA测试和组织学分析表明，直到顺铂治疗后72小时，才观察到sCr和BUN血清学水平的异常变化以及肾脏的组织学异常。图5h总结了基于zcrr的影像/尿液分析与各种临床/临床前DIRF评估方法的比较。基于zcrr的成像和尿液分析能够比sCr和BUN检测早至少60小时，比H&E染色早60小时检测到DIRF，突出了其对DIRF早期诊断的优越敏感性。
实时NIRF成像及尿中DIRF预后分析
然后，作者评估了ZCRR的能力，以评估肾保护疗法的有效性。为了减轻DIRF，顺铂治疗小鼠分别给予代表性药物，包括n-乙酰半胱氨酸(NAC)、苯妥英(PHT)、西司他汀(CIL)、与Vad协同的坏死性他汀-1 (Nec-1)或PBS作为对照组。然后将ZCRR注射到治疗小鼠体内;进行纵向NIRF成像和尿液分析，监测肾脏和尿液信号。注射ZCRR后30分钟，NAC、CIL、PHT或Nec-1/Vad处理小鼠肾脏NIRF信号比pbs处理组低2.0倍、3.2倍、3.7倍或4.2倍，表明药物治疗减少了肾脏的凋亡和损伤。在线和离线尿液分析均观察到平行信号趋势，NAC、CIL、PHT或Nec-1/Vad减轻小鼠的尿液信号分别比pbs处理组低1.5倍和1.5倍，2.0倍和2.5倍，2.4倍和3.0倍，或3.1倍和4.8倍。值得注意的是，在Nec-1/ vad处理的小鼠中，肾脏的NIRF信号明显减弱，健康小鼠的尿液信号下降到接近基础水平。这一观察结果表明，在所有药物中，Nec-1/Vad对肾损伤的修复效果最好，这与生存分析以及之前的报道相一致。因此，基于zcrr的NIRF成像和尿液分析能够区分不同肾保护疗法的治疗效果，使其成为临床前研究中有效的药物筛选工具。
通过测定血清学指标(sCr和BUN)和组织学染色评估肾保护疗法对肾功能的恢复情况。不同治疗组的肾功能恢复趋势与ZCRR的肾清除率一致。作者使用荧光显微镜成像来深入了解上述药物的治疗机制。与pbs处理组相比，在接受各种治疗的小鼠中观察到抗casp8染色和活化的ZCRR信号降低，NAC、CIL、PHT或Nec/ vad处理的小鼠的绿色免疫荧光和NIRF信号比pbs处理组降低1.3倍和1.5倍，1.6倍和1.8倍，2.0倍和1.9倍，或2.2倍和2.5倍。此外，与pbs处理组相比，NAC、CIL、PHT或Nec/ vad处理小鼠的抗casp3免疫荧光染色绿色信号降低了2.2倍、2.5倍、3.3倍和3.4倍，表明肾保护疗法可以减少肾脏细胞凋亡。
组织学分析和存活率进一步证实了这种有效的治疗效果，显示治疗组小鼠肾小管损伤更小，存活率更长。这些结果与之前的研究结果一致，证实了抗氧化剂n -乙酰- l-半胱氨酸(NAC)可以清除细胞ROS，降低溶酶体组织蛋白酶D/ e依赖性caspase-8的激活; 临床使用的DPEP1抑制剂西司他汀可减少肾毒素的摄取，促进中性白细胞的隔离;41苯妥英可减弱RIPK1激酶活性，保护小鼠免受DIRF的侵袭;42而联合抑制坏死坏死(与RIPK1抑制剂Nec1)和caspases(与泛caspase抑制剂zVAD-fmk)对顺铂诱导的死亡有更好的保护作用。
为了评估所有检测方法的敏感性和特异性，进行了受试者工作特征(ROC)分析。与sCr (AUC=0.88)和BUN(0.90)对预后评估的有限预测能力相比，基于zcrr的NIRF成像和尿液分析具有高度歧视性，AUC分别为0.96和0.97。因此，基于zcrr的尿液分析对DIRF的预后评估具有最高的敏感性。
结论
总之，作者介绍了一个具有显著肾脏清除效率和荧光结构的两性离子单分子半青氨酸文库，可用于构建可激活的探针，用于DIRF的早期诊断和预后评估。这些双阴离子半靛碱是通过将磺酸盐/肝酸盐和quats部分结合到传统的半靛碱支架上来开发的，以增强亲水性并减少PPB，从而产生了现有半靛碱衍生物前所未有的高肾清除效率。通过将ZC6与casp8可切割的四肽笼化，进一步构建了一个可激活的肾毒性报告基因ZCRR。在顺铂诱导的DIRF小鼠体内静脉注射ZCRR后，它有效地在肾脏中积累，特异于与DIFR进展和预后相关的Casp8水平的信号“开启”。令人印象深刻的是，尿可排泄的ZCRR还可以通过体外NIRF成像直接分析DIFR，为DIFR的早期检测和监测肾保护治疗反应提供了一种无创和方便的方法，优于典型的临床/临床前检测，如血清BUN/Cr和组织学检查。因此，作者的工作不仅提出了第一个适用于可激活NIRF成像的两性离子单分子半氰胺骨架家族，而且还强调了开发超灵敏NIRF体外检测方法用于临床前和临床环境中肾脏疾病早期诊断的必要性。
参考文献
Tailored Zwitterionic Hemicyanine Reporters for Early Diagnosis and Prognostic Assessment of Acute Renal Failure. Ya Zhou, Lijuan Zhu , Biaoxiang Liu, Weiping Xu, Xingyue Yang, Yi Liu, Bankang Ruan, Shujuan Yi, Baoshuai Liang, Guoqi Dong, and Jiaguo Huang*. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202315457. https://doi.org/10.1002/anie.202315457
