内容提要
通过口服NIR-II比率荧光探针对胃肠道疾病进行早期监测是一种很有前途的无创伤诊断方式，但由于恶劣消化环境的限制，具有挑战性。在这里，我们报道了一种单组分NIR-II比例分子纳米探针(LC-1250 NP)，通过口服对其生物标志物H2O2具有高特异性来监测胃肠道疾病。LC-1250 NP作为胃肠道疾病检测前后的参比，在1250长通通道(F1250LP)中表现出稳定的荧光，而在胃肠道疾病环境下，由于H2O2激活LC-1250分子分子内环化，在1150 nm短通通道(F1150SP)的响应通道中表现出明显增强的荧光信号。荧光比(F1150SP/F1250LP)随H2O2浓度的增加呈线性增加，低检出限为20 nM。因此，LC-1250 NP经口给药时，能准确定位病变区域，克服NIR-II比率荧光成像生物学异质性的假阳性干扰，对胃肠炎的进展提供敏感可靠的评价。
LC-1250的合成很容易通过简单的缩合反应实现，收率高。通过核磁共振(1H NMR和13C NMR)谱和电喷雾电离质谱(ESI-MS)进一步证实了所有化学结构和纯度)。LC-1250由于共轭结构增大，在NIR-II区域(λmax,abs = 1197 nm, DMSO中λmax,em = 1243 nm)出现了本征吸收和发射最大值。同时，LC-1250还具有较高的摩尔消光系数(ε = 1.12 × 105 M−1 cm−1)和绝对荧光量子产率(Φ = 0.064 %， λex = 808 nm)。LC-1250对H2O2的特异性，H2O2作为一种强亲核试剂选择性地促进LC-1250的螺环化，从而产生了强烈的荧光开关。螺旋环对应物可以通过高效液相色谱(HPLC纯化，并通过ESI-MS进一步确认。螺旋环对应物的吸收光谱和发射光谱发生了明显的波长变化(λmax,abs = 850 nm， λmax,em = 1045 nm)，荧光量子产率显著提高(Φ=0.110 %在DMSO中)，这归因于螺旋环内酯形式的共轭体系缩短。
利用高斯09程序进行密度泛函理论(DFT)计算，进一步获得LC-1250的优化几何形状和电子描述。开放型LC-1250的最高已占分子轨道(HOMO)主要离域在给电子部分和聚甲基链上，而最低未占分子轨道(LUMO)主要集中在吸电子部分和π共轭单元上。计算的电子分离结果验证了开放式LC-1250的分子内电荷转移(ICT)效应。相比之下，螺旋环型LC-1250的HOMO和LUMO均沿π共轭分子骨架分布，具有明显的电子云重叠。螺旋环形态LC-1250的振子强度(f = 0.068)和HOMO-LUMO间隙(1.84 eV)均大于螺旋环形态LC-1250 (f = 0.056, 1.54 eV)，表明其荧光强度和蓝移光谱更为显著。
LC-1250经DSPE-PEG2000包封，增强了探针的水分散性和生物相容性。制备的纳米探针LC – 1250 NP在水体系中分散良好。通过动态光散射(DLS)评估LC-1250 NP的大小，在PBS中，纳米探针的平均直径约为56 nm (PDI = 0.176)，有利于细胞摄取。LC-1250 NP的zeta电位为−13.4 mV，这是由于DSPE-PEG具有轻微的负电荷特性。通过透射电镜(TEM)图像测量了纳米探针的球形形态和尺寸，LC-1250 NP由于水化层收缩，尺寸约为40 nm，这与DLS的结果一致。此外，LC-250 NP在H2O、PBS、DMEM和10% FBS中的粒径在7 天内均无明显变化，证实了纳米探针优异的胶体稳定性。LC-1250 NP在NIR-II窗口表现出较强的吸收和荧光发射，最大吸收峰在1200 nm处，最大发射峰在1250 nm处。LC-1250 NP的荧光光谱在30天内没有明显变化，表明其具有良好的存储稳定性。LC-1250 NP在FBS中分散时，荧光亮度明显高于H2O、PBS和DMEM，这可能与染料-蛋白质复合物的形成有关。然而，由于荧光强度的自校准，他们的NIR-II比例荧光成像结果保持一致，表明比例检测的可靠性较高。采用808 nm激光连续照射(100 mWcm−2,60 min)，测试LC-1250 NP在PBS、FBS和水等不同水环境中的光稳定性。LC-1250 NP与ICG相比表现出了优异的光稳定性，这可能是由于环己烯固化了共轭甲基链的刚性结构所致。更重要的是，LC-1250 NP对不同pH条件也表现出良好的耐受性，即使在强酸pH下也没有明显的荧光变化，有望应用于口服监测胃肠道疾病。
加入H2O2后，LC-1250 NP的荧光发射蓝移至1050 nm, 1150 SP通道(响应信号)的荧光强度明显增强。F1150SP/F1250LP的荧光比随着孵育时间和H2O2浓度的增加而增加。随着H2O2浓度的增加，F1150SP/F1250LP的比值强度逐渐增强。同时，1250 LP通道(参考信号)的荧光强度变化可以忽略不计。1150SP通道与1250LP通道之间的荧光强度差异为基于F1150SP/F1250LP的NIR-II荧光比检测H2O2奠定了坚实的基础。在0 ~ 30 μM浓度范围内，F1150SP/F1250LP的比值荧光强度与H2O2成线性正比，计算出极低检测限为20 nM。在808 nm激光照射下，通过双通道NIR-II荧光成像和比值成像也监测了LC-1250 NP对H2O2的显著响应。根据NIR-II比值荧光图像计算出的比值强度与H2O2浓度呈显著的线性相关，尤其有利于基于NIR-II比值荧光成像半定量评估体内H2O2水平。为了评估LC-1250 NP对H2O2检测的特异性，测试了各种潜在的干扰物质，如盐、氨基酸、维生素C (VC)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ClO−、KO2、⋅O2−和ONOO−)对F1150SP/F1250LP比值的影响。正如预期的那样，LC-1250 NP由于H2O2介导的螺环化过程，对H2O2表现出最高的选择性。在LC-1250 NP中加入H2O2后，F1150SP明显增强，F1150SP/F1250LP比值显著增加。此外，比例图像直观地显示LC-1250 NP对H2O2的选择性优于其他分析物。上述结果表明，LC- 1250 NP适用于H2O2的体外定量检测，具有较高的灵敏度和良好的选择性。
接下来，在细胞水平上研究LC-1250 NP对H2O2的响应。先用LC-1250 NP (12.5 μg/mL)孵育3 h，使细胞摄取高效，然后加入Rosup刺激剂诱导H2O2过量产生。与对照组相比，在Rosup孵育30 min后，细胞在1150 SP通道的荧光明显增强，而在1250 LP通道的荧光变化可以忽略，导致比值荧光强度更加突出。重要的是，在加入Rosup前，用ROS清除剂(n-乙酰-半胱氨酸，NAC)预处理细胞1 h，由于ROS水平的下调，细胞1150 SP通道的荧光强度和比值荧光信号被显著抑制。通过对单细胞平均荧光强度(1150 SP和1250 LP)和比值荧光强度的定量分析，也支持了上述结果，即细胞内ROS过量可激活LC-1250 NP。此外，LC-1250 NP即使在浓度为100 μg/ mL时，细胞毒性也可以忽略，这可以通过MTT和活/死染色试验证实。这些结果清楚地表明，生物相容性LC-1250 NP能够通过NIR-II比例荧光成像准确监测活细胞内源性H2O2。
我们评估了LC- 1250 NP在体内应用NIR-II比率荧光成像诊断胃肠道疾病的可行性。肠道炎症是最难治的疾病之一，其特点是H2O2产生过多。传统的多组分比值荧光纳米探针用于检测肠道炎症，在胃肠道酸性或碱性微环境中可能出现结构完整性失效，导致诊断结果不准确。多组分比率荧光纳米探针在体外功能正常。然而，当喂给健康小鼠时，多组分比例荧光纳米探针在恶劣的胃肠道条件下变得不稳定，进一步失去了比例检测功能。在这里，我们的单组分比例荧光纳米探针LC-1250 NP由于其固有的结构完整性而优于多组分荧光探针。因此，我们尝试使用我们的单组分LC-1250 NP检测肠道炎症。
Balb/C小鼠连续喂食5%右旋糖酐硫酸钠(DSS)溶液8天，引起急性肠道炎症，然后禁食24 h后口服LC-1250 NP，以避免可能的食物干扰。小鼠在口服LC-1250 NP前表现出固有的比例荧光信号，尽管1150 SP和1250 LP通道的荧光强度几乎可以忽略。对照组由于正常生理条件下H2O2水平较低，比率荧光信号在检测过程中略有增加。相比之下，DSS组1150 SP通道的荧光强度明显高于对照组，这是由于过量产生的H2O2激活了LC-1250，而1250 LP通道的荧光强度与对照组小鼠一致，导致DSS组的比率强度显著增强。在小鼠死亡后的切除肠中也出现了类似的结果，与正常肠相比，炎症肠中F1150SP/F1250LP的荧光比值显著增强，达到2.3倍(2.76比1.19)。值得注意的是，LC-1250 NP在肠道中的浓度差异会引起绝对荧光强度的明显波动(对照组)，如果仅参考开通道(1150 SP)或常通道(1250 LP)的荧光信号，会导致诊断结果不准确。比率荧光成像可以通过校准参考通道和响应通道中的荧光信号，消除这种模糊性，从而实现对胃肠道疾病的可靠、精确诊断。肠组织H&E染色如图所示。与对照组相比，DSS诱导组肠内折叠黏膜完整性被破坏，黏膜坏死明显，进一步证实了比率成像结果与肠道炎症之间的相关性。
伴随肠道炎症，还可发生胃损伤。使用我们的LC-1250NP纳米探针，我们利用其NIR-II比例荧光信号精确定位损伤部位。区域1的荧光信号在1250LP(始终开启)的参考通道和1150SP(开启)的目标响应通道中较周围组织明显增强。但H&E染色未见明显组织病理学异常(区域1)，提示区域1未见明显炎症或损伤。这种被生物异质性干扰的假阳性结果可以通过NIR-II比值荧光成像(“Ratio”通道)消除，因为其信号强度自校准。相比之下，区域2 1250 LP通道“恒亮”荧光成像显示为阴性信号，但比率荧光成像明确标记为损伤区域，并通过H&E染色进一步验证了这一点(区域2)。总之，上述结果进一步证明LC-1250NP可以通过自我校准荧光强度避免假阳性干扰，可靠地对胃肠道疾病进行原位监测。
LC-1250 NP的生物毒性是其在体内成像应用和潜在临床转译的重要问题。在健康Balb/c小鼠口服LC-1250 NP (2.5 mg/kg)后第1天和第7天，通过血液学评估、血液生化和组织学染色分析进一步评价LC-1250 NP在体内的安全性。如图所示。由于LC-1250 NP具有良好的生物相容性，口服LC-1250 NP后，S26和S27的血液学和生物化学参数无异常波动。胃肠道荧光成像显示LC-1250 NP可迅速且几乎完全排出体外，口服给药后第7天切除的胃肠道内未检测到明显的荧光信号。并通过H&E染色进行组织学分析，评价LC-1250 NP的毒性。主要器官(心、肝、脾、肺、肾、胃和肠道)未见明显的组织病理形态变化，表明LC-1250 NP在体内毒性可忽略。综上所述，我们认为LC-1250 NP具有良好的生物相容性，具有良好的体内应用潜力。
在本工作中，我们开发了一种口服NIR-II比例探针LC-1250 NP，由于其在恶劣的胃肠道环境中突出的耐受性，在可靠监测胃肠道疾病方面显示出巨大的临床应用潜力。与现有的NIR-II比例探针相比，LC-1250 NP具有以下几个方面的优势:(1)通过合理设计和高效合成，可以获得具有固有生物相容性和生物降解性的小分子探针LC-1250。(2) LC-1250 NP具有清晰的化学结构，避免了在多组分比例体系中精确控制不同功能组分化学计量的麻烦。(3) LC- 1250 NP对H2O2具有良好的选择性和敏感性，被认为是早期检测胃肠道疾病的可靠生物标志物。(4) LC-1250 NP具有良好的胶体稳定性、光稳定性和储存稳定性，口服后在消化道中表现出显著的比例特征。
由于探针浓度或微环境的变化引起荧光波动而产生的假阳性是荧光成像不可避免的障碍。假阳性结果可能误导医生对疾病做出不准确的评估和治疗。当探针是口服给药时，这个问题变得更加棘手。高浓度的纳米探针在肠道中会产生强烈的荧光信号，导致假阳性误差不明确。然而，通过NIR-II比例荧光成像可以很容易地消除这一固有的荧光成像问题。LC-1250 NP成功避免了胃区荧光检测假阳性，并通过NIR-II比例荧光成像准确绘制了损伤区域。此外，LC-1250 NP是口服造影剂，减轻了纳米材料注射入血液后潜在的长期风险。这些结果表明LC-1250 NP是一种通过NIR-II比例荧光成像监测胃肠道疾病的潜在口服造影剂。
结论
我们首次报道了一种口服NIR-II比例荧光纳米探针(LC-1250 NP)，用于准确可靠地检测体内胃肠道疾病。开放形态的LC-1250经H2O2介导的螺环化过程特异性转化为其螺环对应物，其发射峰从1243 nm显著蓝移至1045 nm。同时，在螺旋环化过程中，1250LP通道的内部参考信号基本不变，而1150SP通道的响应信号显著增加，从而实现了可靠、鲁棒的比值信号读出(F1150SP/F1250LP)。此外，LC-1250 NP在消化微环境中具有良好的稳定性和不受干扰的比例特性，成功应用于口服可靠的胃肠道疾病监测。口服LC-1250 NP避免了多组分比率荧光系统复杂的设计和合成过程，在体内准确可靠地监测胃肠道疾病方面具有巨大的临床应用潜力。
参考文献
An oral ratiometric NIR-II fluorescent probe for reliable monitoring of gastrointestinal diseases in vivo. Tuanwei Li , Kaili Cao, Xiaohu Yang ,Yongyang Liu, Xingyu Wang, Feng Wu, Guangcun Chen, Qiangbin Wang. Biomaterial, 293(2023)121956. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121956
