内容提要
我们报告了一类新的三甲碱骨架 NIR-II 荧光团(NIR-II Cy3s)，其稳定性优于传统的七甲碱 NIR-II 荧光团，发射波长超过1000 nm。NIR-II Cy3s可以可逆地响应HClO和活性硫 (RSS)，并且可以作为在病理生理学环境中可逆地监测HClO/RSS介导的氧化还原过程的有效平台。最后，我们将 NIR-II Cy3-988应用于急性炎症模型中氧化还原环境和药物治疗动态效果的可逆评估以及肝损伤和修复过程中的氧化还原电位变化。
实验结果与讨论
菁染料具有消光系数高、吸收带窄的特点，可能是近红外荧光传感和成像中最常用的有机染料一般来说，典型的三甲基氰化物(Cy3)在<600 nm处表现出吸收和发射，荧光团骨干被一个乙烯基基团延伸可导致大约100 nm的光变色偏移最近，Sletten，Zhang等团队建立了一些黄酮基的五甲基氰和七甲基氰。这些研究成功地将蓝菁的发射波长最大值扩展到1000 nm以上，并已广泛应用于活体成像。然而，一些组和我们的研究表明，随着乙烯链的延伸，菁染料的化学稳定性和光稳定性急剧下降。因此，这一策略并不适合开发基于五甲基菁和七甲基菁NIR-II染料的氧化还原可逆荧光探针。因此，通过端基修饰来开发NIR-II三甲基菁染料可以克服这些限制，因为它们具有良好的化学稳定性和光稳定性。
我们以前的工作表明，氨基苯并芘取代的三甲基菁的吸收和发射都导致了明显的红移例如，NIR-I Cy3-728是一种二乙基氨基苯并芘取代的三甲基菁，位于758 nm处，其发光比Cy3明显红移。因此，通过端基修饰来红移三甲基氰化物的发射波长是可行的。密度泛函理论(DFT)计算表明，NIR-I Cy3-728的最高已占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)水平都增加了，其中HOMO水平比LUMO水平增加得更快，最终导致带隙缩小。因此，在三甲基骨架中引入了一个更富电子的DQ苯并芘端基，该端基可以进一步减小HOMO/LUMO的能隙。得到的染料NIR-I Cy3-784在784/ 840 nm处表现出红移的最大吸收/发射;但是，它仍然位于近红外I区。DFT计算表明，LUMO态大部分沿分子骨架离域。然而，HOMO上更多的π电子强烈定位在富电子基团的特定键上，因此有效地提高了HOMO的能级，超过了NIR-I Cy3-728和Cy3基于这些结果，在三甲基骨架中通过双边取代逐渐引入了富电子的端基，如黄蒽、DQ苯并吡喃及其衍生物，用于设计染料NIR-II Cy3-938/956/962/988。正如预期的那样，它们在NIR-II区域(938/1001 nm、956/1005 nm、962/1015 nm和988/1058 nm)成功实现了吸收和发射波长，量子产率为0.065% ~ 0.17%(参考IR 26=0.05%) 。此外，富含电子的DQ部分极大地影响了调整后的电子离域，通过提升HOMO轨道导致波长延长。它也可能为可逆探针的设计提供一个氧化位点如预期的那样，采用合理的分步设计策略，基于三甲基骨架结构构建NIR-II染料，有效提高了波长和稳定性，为NIR-II窗口的可逆成像提供了可行的工具。
我们首先研究了NIR-II Cy3s在生理条件下的稳定性，以验证我们的假设。为了进行化学稳定性测试，将各种ROS(如H2O2、HClO和ONOO-)和RSS(如H2S、Cys、GSH)加入到NIR-II Cy3s在PBS (pH 7.4，含50%乙醇)中的溶液中，并将结果与IR 26、IR 1048、IR 1061、ICG等商用NIR-II七甲基花菁染料和最近报道的NIR-II七甲基花菁染料Flav 7和CX-3进行比较。大多数已报道的NIR-II七甲基花菁在溶液中存在ROS或RSS时表现出严重的结构损伤，并表现出吸收光谱的大幅下降。相反，在所有测试的RSS和大部分ROS存在时，NIR-II Cy3s的吸收光谱和荧光光谱几乎没有变化。这些结果表明，基于三甲基骨架合成的NIR-II Cy3的化学稳定性得到了提高。值得注意的是，与在HClO溶液中吸收减弱的NIR-II七甲基花菁相比，NIR-II Cy3在最大吸收时的吸收峰明显下降，还观察到一个新的蓝移吸收带。这一现象表明，新型NIR-II Cy3可能被HClO氧化而没有结构损伤。这些结果进一步证实了三甲胺骨架染料比七甲基氨酸骨架染料具有更强的稳定性。高分辨率质谱(HRMS)显示，NIR-II Cy3-962与HClO反应后，m/z从708.3796增加到724.3745，表明染料的共轭结构中增加了一个氧原子。我们推测这可能是由于NIR-II Cy3-962中具有较强供电子能力的quinoxaline基团被HClO氧化形成Noxide，这可以解释吸收光谱的变化。值得注意的是，与化合物NIR-II Cy3-962和NIR-II Cy3-956各有一个喹诺酮基团不同，染料NIR-II Cy3-938和NIR-II Cy3-988各有两个喹诺酮基团，它们与HClO反应后的m/z约增加32。这一结果进一步表明喹喔啉是这些新型NIR-II Cy3s被氧化的主要部位。此外，光声(PA)成像显示，经过HClO处理后，新型NIR-II Cy3s，如NIR-II Cy3-988，在820和980 nm激发时表现出明显的比例PA响应。这些结果与它们的吸收光谱相一致，表明新型NIR-II Cy3s具有开发用于HClO检测的比例光声探针的巨大潜力。
考虑到n -氧化物可以很容易地通过还原剂转化为胺，然后我们研究了这些NIR-II Cy3s是否可以用作可逆性NIR-II荧光探针，用于检测ROS (HClO)和还原剂。我们选取吸收和发射光谱最长的NIR-II Cy3-988为例，并将其性能与标准七甲基花菁染料IR 1048进行比较。NIR-II Cy3-988在PBS中在980 nm处表现出强烈的吸收，在1040 nm处发射。但是，随着HClO (0 ~ 15 μM)的加入，其在980 nm处的吸收和1040 nm处的发射逐渐下降，而在824 nm处观察到一个新的蓝移吸收带。随后向NIR-II Cy3-988 '溶液中加入还原剂H2S，导致吸收(980 nm)和荧光信号(1040 nm)的恢复。这些结果表明，新型NIR-II染料对HClO的反应是可逆的，可以被还原剂H2S逆转。从可逆响应循环试验可以明显看出，探针NIR-II Cy3-988的氧化还原循环过程至少可以重复4次，同时利用HRMS/液相色谱-质谱(LC-MS)也可以准确捕获整体可逆过程。此外，体外光声实验也很好地监测了这个可逆过程。相比之下，广泛使用的NIR II造影剂IR 1048在相同条件下对HClO产生不可逆反应。进一步的实验表明，与H2S类似，其他还原性RSS(包括GSH、Hcy和Cys)也能恢复探针荧光;然而，它们的恢复效果略弱于H2S。这可能是由于与其他还原性RSS相比，H2S的分子尺寸更小，氧化还原电位更负，这些数据表明，NIR-II Cy3-988可以作为NIR-II探针在HClO/ RS介导的氧化还原环境中进行可逆成像。
考虑到荧光团的光稳定性是评价其成像性能的重要标准，我们通过连续激光照射检测了新型NIR-II Cy3s在生理条件下的光稳定性。无论是否加入GSH, NIR-II Cy3s都比ICG表现出更高的光稳定性，使其更适合长时间的活体成像。此外，pH稳定性研究表明，大多数NIR- ii Cy3s在不同pH的溶液中表现出较高的稳定性，只有含有羧基的NIR II-Cy3-956和NIR II-Cy3-962染料在低pH环境中表现出较低的吸收和荧光强度。这可能是由于染料NIR II-Cy3-956和NIR II-Cy3-962在较低的pH值下溶解度降低。为了验证这一点，我们在低pH值环境(pH值3和pH值4)中加入三乙胺(TEA)，染料NIR II-Cy3-956和NIR IICy3- 962的猝灭吸收被恢复。上述结果表明，它们在酸性环境中具有很高的稳定性。此外，抗猝灭实验表明，与七甲基骨架基NIR-II染料相比，NIR-II Cy3s具有更好的抗溶剂致变色猝灭性能，使NIR-II荧光成像在体外和体内都更亮。这些数据表明NIR-II cy3是很有前途的NIR-II荧光团或探针，可用于生物成像应用。
然后我们测试了NIR-II Cy3-988作为活体成像的可逆NIR-II探针的能力。首先，用吸收光谱法测定了NIR-II Cy3-988在10%胎牛血清(FBS)中的溶解度。结果表明，NIR-II Cy3-988在10% FBS中具有良好的溶解性，其最大吸收强度随浓度的增加呈线性增加。然后，我们采用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基- 2H-四溴化铵)MTT法评价NIR-II Cy3-988的细胞毒性，结果表明NIR-II Cy3-988在浓度低于20 μM时对细胞活力没有显著影响。接下来，用NIR-II Cy3-988探针研究活小鼠对外源性HClO和代表性RSS (H2S)的可逆反应。将HClO肌注到与探针NIR-II Cy3-988预孵育的右后腿中，在980 nm激发下，NIR-II荧光信号在实验区域立即猝灭(150 s)，在此条件下仅观察到初始强度的45%。然而，在同一部位注射50 μL H2S (200 μM)后，NIR-II荧光在70分钟内基本恢复到初始水平。相比之下，注射NIR-II Cy3-988探针的小鼠左后腿在整个过程中荧光强度恒定。需要注意的是，当传统探针IR 1048用于小鼠成像时，未观察到恢复的NIR-II荧光。这些数据说明NIR-II Cy3-988探针可作为活体小鼠HClO和过氧化氢过饱和度(H2S)可逆检测的有效工具。
与炎症相关的氧化还原失调是疾病发展和进一步恶化的重要因素一般情况下，炎症损伤后巨噬细胞的积累导致高水平的趋化因子表达，如CC -趋化因子配体2 (CCL2)和cxc -趋化因子配体1 (CXCL1)，以招募单核细胞和中性粒细胞。然后，来自招募的中性粒细胞的过多的髓过氧化物酶(MPO)过度产生反应性氧化剂，包括HClO，导致炎症部位的氧化损伤为了防止过度氧化损伤，在临床实践中，通常使用阿司匹林、双氯芬酸和布洛芬等非甾体类抗炎药(NSAIDs)通过抑制中性粒细胞的招募来进行组织修复和减少炎症然而，由于缺乏可逆的NIR-II荧光探针，在体内评估这些药物的抗炎效果仍然是一个挑战。
接下来，我们考察了NIR-II Cy3-988探针能否基于其对氧化应激(HClO和RSS)的可逆性检测，用于药物疗效的体内评价。C57小鼠右后腿肌肉注射角叉菜胶诱导急性炎症，左后腿注射等量PBS作为对照。然后在C57小鼠左右后腿肌肉注射NIR-II Cy3-988，检测到NIR-II荧光信号。随着内源性次氯酸的产生，小鼠右后腿区的NIR-II荧光信号在60 min内逐渐减弱。然而，在注射N -乙酰- l-半胱氨酸(NAC)(一种广泛用于治疗炎症的药物)后，减弱的信号可以随着时间的推移恢复。相比之下，肌肉注射NIR-II Cy3-988后，左后腿持续观察到稳定的NIR-II信号。我们进一步从组织的苏木精和伊红染色(H&E)中确定了这些不同的组织学变化。这些结果表明，NIR-II Cy3-988探针可以可逆地检测炎症和抗炎过程中氧化应激的变化、氧化微环境以及炎症过程中药物治疗的效果。体内。接下来，进一步利用NIR-II Cy3-988，通过氧化应激检测，评价各种非甾体抗炎药(阿司匹林、双氯芬酸和布洛芬)在角叉菜胶诱导的急性炎症模型中的抗炎作用。双氯芬酸抗炎效果最好，可恢复角叉菜胶诱导的小鼠NIR-II荧光信号减弱这可能是因为双氯芬酸可以快速抑制中性粒细胞的招募以减少MPO，甚至抑制巨噬细胞的积累结果发现，炎症组织中的HClO水平和氧化应激水平因RSS的增加而降低。为了验证这一过程，我们接下来在炎症和双氯芬酸治疗组中使用H2S探针(TPQL-N3)和GSH探针(NIR II-HD5-GSH)进行荧光成像，与损伤组相比，双氯芬酸治疗后小鼠大腿组织中H2S或GSH探针的荧光信号明显增强。这些结果表明双氯芬酸确实可以通过上调RSS水平来治疗炎症。白细胞介素-12 (IL-12，炎症因子)和胱硫氨酸β合成酶(CBS，硫化氢合成的催化酶)的酶联免疫吸附测定(ELISA)进一步证实了上述结果。所有这些结果表明，NIR-II Cy3-988可以作为一种潜在的可逆检测炎症过程中氧化微环境异常变化和药物治疗效果的工具。
肝脏作为重要的代谢器官，参与代谢以维持正常的生理功能。在病理状态下，由于氧化应激，肝细胞会受到损伤，引起肝脏代谢稳态紊乱ICG作为一种临床批准的造影剂，通过研究肝脏代谢能力，被广泛用于评估肝损伤但ICG稳定性差，且被ROS不可逆破坏，不适合用于肝损伤变化的可逆检测。然后我们用NIR-II荧光成像检测NIR-II Cy3-988是否可以在体内可逆地监测肝脏损伤和修复过程，并将结果与ICG进行比较。首先，我们评估了NIR-II Cy3-988和ICG作为肝损伤可视化探针的能力。昆明小鼠随机分为三组，分别给予生理盐水、CCl4或CCl4+NAC处理。在给药NIR-II Cy3-988和ICG后，注射生理盐水的健康小鼠在肝脏的绿色通道(ICG)和红色通道(NIR II Cy3-988)均显示出明亮的NIR-II荧光。然而，在CCl4预处理12小时后，观察到小鼠肝脏中两个通道的荧光明显下降。这些数据表明，由于CCl4诱导的肝损伤，小鼠肝脏中的ROS (HClO)明显增加。值得注意的是，当我们用CCl4预处理小鼠，然后用NAC处理它们时，与只接受CCl4的小鼠相比，绿色通道和红色通道的荧光都显著恢复。说明NAC对CCl4诱导的肝损伤有修复作用，NIR-II Cy3-988和ICG均能显像。为了进一步验证NAC是否可以通过上调RSS水平来修复肝损伤，我们使用H2S (TPQL-N3)和GSH探针(NIRII-HD5-GSH)来可视化修复过程如图所示，NAC处理仅1小时，与肝损伤相比，在NAC修复过程中，随着时间的增加，TPQL-N3的荧光信号明显增加。值得注意的是，使用GSH探针也观察到NAC处理小鼠的荧光信号逐渐增强。IL-12和CBS的ELISA结果进一步证实了上述观察结果。以上结果表明，NAC可上调肝脏内的RSS(包括H2S和GSH)水平以治疗肝损伤，这与以往文献报道一致此外，我们还可以观察到绿色通道和红色通道的荧光明显重叠。利用PBS进行的体外研究证明，当被808 nm和980 nm激光激发时，ICG和NIR-II Cy3-988通道的集体荧光没有串扰;因此，重叠图像反映了实际NIR-II Cy3-988和ICG的分布，说明NIR-II Cy3-988和ICG在肝脏组织中的分布位置几乎相同。H&E研究结果显示，与ICG相似，NIR-II Cy3-988具有良好的生物相容性，在小鼠体内不造成器官损伤。所有这些结果表明，与ICG一样，NIR-II Cy3-988可用于肝毒性的可视化。
接下来，我们评估了NIR-II Cy3-988在体内可逆监测肝毒性的能力。在健康小鼠的肝脏中，NIR-II Cy3-988的荧光信号持续增加，在3 h时最强。然而，在CCl4处理后，由于高氧化应激，即使成像时间延长3 h，小鼠的荧光信号也非常微弱。相比之下，ICG在30 min时荧光最强，且肝损伤组的荧光明显低于对照组。这些结果与我们本研究的研究一致，也表明ICG在肝脏中的代谢速度比NIR-II Cy3-988快。值得注意的是，当我们用CCl4预处理小鼠诱导肝损伤，然后注射NIR-II Cy3-988和ICG成像1 h，之后再注射NAC解药继续成像时，观察到NIR-II Cy3-988通道荧光明显增强。与肝损伤组相比，ICG在NAC处理后小鼠肝脏的荧光信号几乎没有增加。这些结果表明，NIR-II Cy3- 988确实可以通过其可逆的氧化还原反应监测肝损伤和修复过程中的氧化应激变化。组织学分析进一步证实了这些肝组织的不同组织学变化。三甲胺骨架的良好稳定性和NIR-II Cy3-988的可逆反应，使我们能够首次使用NIR-II荧光成像可视化肝损伤中氧化应激的波动和修复。
结论
本研究通过引入DQ苯并吡喃并逐步优化到三甲基骨架中，研制了一系列抗猝灭性能更高的新型高稳定性NIR-II Cy3s染料。与传统的七甲基氰NIR-II染料相比，NIR-II Cy3s由于骨架的稳定性和富电子DQ基团对HClO/RSS的可逆响应，可以用于HClO/RSS介导的氧化还原环境的可逆检测。NIR-II Cy3-988已成功用于检测急性炎症和肝损伤/修复模型中氧化微环境的变化，也可用于急性炎症过程中的药物疗效评价。基于吸光度的比值变化，NIR-II Cy3s也有实现疾病过程中比值光声成像的可逆检测的前景。我们相信，我们的工作释放了NIR-II荧光团在氧化还原态可逆成像方面的潜力，并重新点燃了对稳定的NIR-II菁染料的兴趣，用于精确的生物成像和生物传感。进一步的工作，如提高探针的量子产率和水溶性，实现可逆的NIR-II比率检测，正在进行中。
参考文献
Engineering of Reversible NIR-II Redox-Responsive Fluorescent Probes for Imaging of Inflammation In Vivo. Long He, Lin-Hui He, Shuai Xu, Tian-Bing Ren,* Xing-Xing Zhang, Zuo-Jia Qin, Xiao-Bing Zhang, and Lin Yuan*. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, e202211409. doi.org/10.1002/anie.202211409
