内容摘要
化学发光具有消除激发光和最小的自身荧光干扰，已广泛应用于生物传感和生物成像。然而，传统CL探针的发射主要在400 ~ 650 nm范围内，导致在生物物体中的分辨率和穿透性不理想。因此，在近红外窗口[NIR，包括NIR-Ⅰ(650 ~ 900 nm)和近红外-Ⅱ (900 ~ 1700 nm)]中开发CL分子具有成像时间长、响应灵敏、毫米深度分辨率高的独特优势，迫在眉睫。然而，目前尚未见NIR-II CL单分子探针的报道。在此，作者开发了H2S激活的NIR-II CL探针[化学发光供体950，(CD950)]，通过分子内CL共振能量转移策略，将两个具有高化学能的Schaap的二西烷供体与一个NIR-II荧光团受体候选共价连接，从而实现了95%的高效率。CD-950在长时间成像(~60 min)、深层组织穿透(~10 mm)和生理条件下H2S特异性反应等方面表现出优异的能力。更重要的是，CD-950显示出对二甲双胍诱导的肝毒性的检测能力，其信号背景比比NIR-II荧光模式高2.5倍。单分子NIR-II CL探针在体内追踪其代谢产物评估药物副作用方面具有巨大潜力，进一步促进了基于NIR-II CL的新型检测平台的合理设计。
结果与讨论
CD-950的设计与合成。CD950的合成过程如图所示。概述的信息分为三个主要部分，包括C-700, D-970和CD-950的合成。化合物1由研究中报道的修改程序合成。首先将苯中的溴替换为醛基，再将醛基还原为苯甲醇，得到化合物3。按照碘化反应、Heck偶联反应、氧化反应、酯水解等合成路线，得到相应的产物7。化合物7经Knoevenagel缩合与双氰甲基色酮反应得到化合物8，该化合物被认为是NIR-I CL的骨架。然后，在化合物8的苯酚位置引入H2S可裂解的2,4-二硝基溴苯(54)，形成C-700,9的前驱体。通过单线态氧的氧化，前体9经过[2+2]环加成得到CL给体C-700。在第二部分，作者合成了荧光团(D970)。同样地，以4-溴三苯胺为原料，先制得硝化产物11，再经宫浦硼化反应得到化合物12。随后，通过化合物12与BBTD的铃木偶联反应制备了化合物13。通过还原硝基和环化反应，最终得到蓝色固体D-970。以C-700和D-970为原料，通过简单的酰胺化反应得到目标NIR-II CL探针CD-950。1H NMR、13C NMR和ESI-MS表征证实了CD-950分子的成功制备。
CD-950对H2S的响应。作者首先分别评估了C-700和D-970的光学性能。C-700和D-970分别在700 nm和740 nm处显示出最大的发射峰和吸收峰。由于C-700和D-970之间有很高的光谱重叠，两个单元显示出潜在的高效CRET工艺。正如预期的那样，Na2S在950 nm处显示出最大的NIR-II CL信号增强，比未加Na2S处理的CD-950提高了32.9倍，表明存在分子内CRET过程。CD-950的发射波长相对于D-970蓝移约20 nm。这些给电子氨基增强了D-970的分子内电荷转移效应，减小了其带隙，导致在970 nm处出现最大发射峰。在CD-950中，这些氨基变成了酰胺键，并降低了它们的给电子能力，导致CD-950的发射光谱发生蓝移。除了有明显的NIR-II CL信号外，在H2S的存在下，工作溶液的颜色发生了明显的变化。在图C中，C-700、Nano-970(封装C-700和D-970的纳米微粒)和CD-950加入Na2S后颜色立即发生明显变化。同时在Nano-970和CD-950中分别观察到明显的NIR-II CL信号。虽然C-700也显示出明显的颜色变化，但在NIR-II窗口中没有检测到信号。CD950的NIR-II CL信号表现出标准的CL动力学特征，快速上升至最大值，然后下降到可以忽略的水平。CD-950的NIR-II CL半衰期为23.5 min。此外，反应动力学研究表明，加入Na2S溶液后10 s内就发生了活化。
组织穿透深度对活体生物成像至关重要。因此，将CD-950和Nano-970的NIR-II CL信号作为模拟组织通过1000 nm长通滤波器进行记录。激活CD-950的NIR-II CL信号可检测到10 mm，而Nano-970的检测阈值为6 mm。组织穿透深度的差异是由于CD-950在1000 nm处的NIR-II CL强度更高。当鸡肉火腿厚度达到2 mm时，CD-950的NIR-II CL强度最大SBR为8.9，约为Nano-970的4.7倍。这些结果清楚地表明，共价偶联通过高效的分子内CRET过程提高了单分子探针CD-950的发光强度。
为了验证探针对H2S的特异性响应，记录了CD-950与不同浓度H2S反应后的波动信号。CD-950的NIR-II CL发射强度随着Na2S浓度的增加而增加，而NIR-II FL信号几乎保持不变。同时，CD-950在1000 nm处的NIR-II CL发射强度与Na2S浓度在0 ~ 200 μM范围内呈广泛的线性相关。作者进一步测试了CD-950对H2S对其他生物相关的活性硫、氧、氮物种和金属离子(如Ca2+、Fe2+和Mg2+)的选择性。CD-950对干扰物种的NIR-II CL反应可以忽略不计。此外，对H2S的反应被GSH和l -半胱氨酸生理水平的存在最低限度地干扰。这些结果表明，CD-950对H2S具有最佳的选择性和响应能力。因此，CD-950可以作为一种可靠、精确的NIR-II CL探针用于H2S的敏感检测。
响应机理及理论计算。鉴于CD-950优异的光学性能，本文提出的活化机理如图所示。二西烷-荧光团缀合物(I)随着2,4-二硝基苯酚的分离而分解生成化学激发前体(II)。在CIEEL机制下，前体(II)的高活性被自发触发，接触到化学激发的苯甲酸酯，将其化学激发能量传递给NIR-II荧光团，导致荧光团(III)激发，激发中间体衰变到基态(苯甲酸酯-荧光团共轭酯IV)，并伴随NIR-II光子发射。
为了进一步阐明CD-950的能量共振传递过程，在Cam-B3LYP/6-311G*水平进行了基于密度泛函理论和时变密度泛函理论的相关计算。首先，计算得到的C-700- R的发射光谱(C-700- R是C-700响应H2S后的产物)与D-970的激发光谱有明显重叠，与实验结果一致。因此，实验和理论结果都验证了CRET在CD-950和Nano-970系统中的潜在可能性。其次，它清楚地表明化合物[IV(1.65 eV)]的激发能小于C-700-R (2.37 eV)。通过比较S1→S0跃迁的振子强度(f值)，化合物(IV)的f值(f = 0.77)高于Nano-970- r (Nano-970- r是Nano-970响应H2S后的产物，f = 0.43)，这可能解释了它们发光强度的差异。优化激发态的化合物(IV)在配对的D-970和C-700-R之间的质心距离为1.97 nm。结合CD-950明亮的NIR-II CL信号，这个距离可能适合实现CRET(59,60)。通过类比FRET能量转换公式，得到了95.0%的CRET效率。因此，CD-950在NIR-II窗口的CL成像中具有明显的优势。
H2S的体外NIR-II CL成像。然后研究了细胞中H2S激活CD-950的NIR-II CL成像。通过CKK-8试验评估MC38-luc细胞、MCF-7细胞和正常LO2细胞的潜在细胞毒性。这些细胞在不同浓度CD-950(最高100 μM)孵育24 h后表现出良好的细胞相容性，表明CD-950具有良好的生物安全性。用探针处理这些细胞30 min后，MC38-luc中检测到NIR-II CL成像信号，而MCF-7和LO2细胞中未记录到NIR-II CL信号。由于CD-950在808 nm激光照射下NIR-II FL成像信号始终处于开启状态，且强度取决于CD-950的浓度，因此三个实验组的NIR-II FL成像强度几乎相同。作为对照，用氨基氧乙酸(AOAA，内源性H2S的抑制剂)和ZnCl2(内源性H2S的清除剂)预处理后，CD-950处理的MC38-luc细胞中的NIR-II CL信号显著降低。这些结果归因于MC38-luc表达高水平的H2S，而MCF-7和LO2几乎不表达H2S，证实了CD-950在活细胞中敏感检测H2S的可行性。
为了进一步评估CD-950对细胞中不同H2S浓度的检测可靠性，作者首先在LO2细胞中加入不同浓度的Na2S溶液10分钟，然后与CD-950孵煮30分钟。相应的NIR-II CL强度随着Na2S浓度的增加逐渐增加，而NIR-II FL强度保持不变。NIR-II CL和NIR-II FL的平均强度值如图所示。NIR-II CL强度的定量分析与Na2S浓度呈线性关系。这些结果进一步揭示了CD-950在准确评估细胞中H2S的潜力。
肿瘤中H2S的活体NIR-II CL成像。利用CD-950优异的体外NIR-II CL性能，研究了H2S对MC38-luc荷瘤小鼠的体内成像。首先，研究了CD-950的生物相容性。CD-950 (200 μM, 200 μL)静脉注射24 h后，苏木精和伊红(H&E)染色结果显示，主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)未见明显炎症或病变，进一步证明CD-950具有良好的生物相容性。当肿瘤大小达到~100 mm3时，将100 μM CD-950注入40 μL(含85%生理盐水、10%二甲基亚砜(DMSO)、5% Tween-80)的荷瘤小鼠体内，获取不同时间点小鼠的NIR-II CL和NIR-II FL图像。注射CD-950 1 min后，肿瘤部位可见明显的NIR-II CL信号。NIR-II CL信号逐渐升高，在3 min时达到平台，20 min后降低至基线。同时NIR-II FL信号在注射后肿瘤区域保持稳定的强度范围。注射后3min, NIR-II CL成像的SBR比NIR-II FL成像的SBR高3.1倍，进一步说明NIR-II CL成像的SBR比NIR-II FL成像的SBR高。
接下来，为了准确评估探针CD-950响应肿瘤区域H2S动态变化的可行性，作者分别用生理盐水、L-Cys、Na2S、AOAA和ZnCl2对荷瘤小鼠进行预处理。首先，在肿瘤中注射L-Cys溶液刺激H2S水平时，NIR-II CL信号较对照组明显增强。为了进一步验证对外源性H2S的成像能力，作者在活体成像之前在肿瘤部位注射Na2S。与预期的一样，Na2S预处理后，NIR-II CL发射更强。AOAA预处理6 h后，NIR-II CL信号显著降低。同样，瘤间注射ZnCl2清除H2S，肿瘤区域没有明显的发光信号。这些结果进一步反映了CD-950对肿瘤中H2S波动的准确响应。
H2S在二甲双胍诱导肝损伤中的NIR-II CL成像。为了进一步验证活体NIR-II CL成像的优势，作者建立了二甲双胍诱导的肝毒性模型。首先，通过静脉注射CD-950, CD-950的血液半衰期(12.2 min)表明该探针从血液循环中迅速代谢。静脉注射CD-950盐水处理小鼠，体内和体外NIR-II FL成像显示，在808 nm激光照射下，1000 nm长通滤波器照射50 ms，肝脏显示出明亮的NIR-II FL信号。然而，在健康小鼠的肝脏中未观察到显著的NIR-II CL排放。同时，作者测试了不同剂量二甲双胍预处理小鼠CD-950的NIR-II CL成像信号。用2 mg二甲双胍预处理小鼠7 d后，注射CD-950后2 min容易观察到NIR-II CL成像信号，是盐水处理小鼠的2.2倍。由于低剂量二甲双胍仅诱导低浓度H2S，在注射后4 min未检测到明显的NIR-II CL成像信号。当二甲双胍剂量分别增加到4 mg和6 mg时，观察到明显而持久的NIR-II CL信号。肝毒性小鼠的最大NIR-II CL强度是对照组小鼠的3.9倍，NIR-II CL成像纵向时间长达15分钟。同样，在注射后2分钟，从二甲双胍处理(6 mg)的小鼠中切除器官时，在肝脏中检测到清晰的体外NIR-II CL成像信号。根据6 mg二甲双胍处理的NIR-II CL和NIR-II FL的强度分布图，确定肝脏水平方向大小分别为15.5 mm和28.4 mm。目标部位NIR-II CL成像最大SBR高达4.2，比NIR-II FL成像(1.7)高2.5倍。NIR-II CL成像与NIR-II FL成像在肝脏大小上的明显差异表明，在同一动物模型中，NIR-II CL成像比NIR-II FL成像具有更高的灵敏度和分辨率，能够准确定位肝脏边缘。
为了进一步确认肝损伤的程度，作者评估了两个重要的肝脏指标，天门冬氨酸转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性，结果如图所示。随着二甲双胍剂量从2 mg增加到6 mg，二甲双胍治疗小鼠的AST和ALT水平显著升高，这进一步被不同的组织病理学损伤所证实。H&E染色结果也显示了不同剂量二甲双胍治疗时相应的肝细胞肿胀、脂质空洞、肝坏死等肝损伤特征。基于这些结果，CD-950可用于观察肝脏H2S的上调，并评估二甲双胍诱导的肝损伤的严重程度。
结论
作者首先构建了H2S激活的单分子NIR-II CL探针(CD-950)，其最大发射波长为950 nm。在合理设计CL供体(C-700)和荧光受体(D-970)的基础上，实现了在生理条件下高效的CRET工艺。单分子探针CD-950获得了明亮的NIR-II CL，还表现出更深的组织穿透(~10毫米)，长持续时间(~60分钟)，以及特异性和快速的H2S反应的显著特征。此外，用CD-950探针可以很容易地检测癌细胞和活组织中H2S的动态波动。更重要的是，在二甲双胍诱导肝毒性小鼠模型中，NIR-II CL成像比NIR-II FL成像具有更高的灵敏度和分辨率，表明其在预测药物副作用方面具有重要意义。作者相信，他们设计的策略将进一步推动生物成像和临床翻译应用的NIR-II CL传感平台的发展。
参考文献
Design and synthesis of a small molecular NIR-II chemiluminescence probe for in vivo-activated H2S imaging. Zhongxiang Chen, Lichao Su, Ying Wu, Jianyong Liu, Rongrong Wu, Qian Li, Chenlu Wang, Luntao Liu, and Jibin Song. PNAS,2205186120. https://doi.org/10.1073/pnas.2205186120
