内容摘要
基于小分子的第二近红外(NIR-II)激活荧光探针可以潜在地提供高靶背景比和深层组织穿透。然而，大多数报道的NIRII可激活小分子探针由于缺乏一般和稳定的光学可调基团而表现出较差的通用性。在本研究中，作者设计了一种用于NIR-II探针开发的新型染料支架NIRII-HDs。其中，NIRII-HD5表现出最佳的光学性能，如适当的pKa值、良好的稳定性和较高的NIR-II亮度，有利于高对比度的体内成像。为了证明NIRII-HD5染料的适用性，作者设计了三种用于ROS、硫醇和酶的靶向激活NIR-II探针。使用这些新型探针，作者不仅在小鼠模型中实现了不同疾病的可靠NIR-II成像，而且还在体内以高保真度评估了肝损伤期间肝组织的氧化还原潜力。
结果与讨论
为了设计出与O-HD性能相似的HD-like NIR-II染料，作者认为需要以下步骤:1)增强O-HD吲哚杂环部分的给体强度，以延长其发射;2)在O-HD的破坏位点引入盖层基团，以增加其稳定性;3)降低O-HD或其类似物酚基的pKa值，以增强其相应分子探针在生理环境下的响应性能。基于这些考虑，作者设计合成了新型类HD的NIRII染料NIRII-HD5。为了获得NIR-II发射，作者首先用具有富电子特征的1,4-二乙基十氢喹啉(DQ)苯并吡喃取代O-HD的弱给电子基团吲哚杂环，得到NIRII-HD1。正如预期的那样，NIRII-HD1在PBS缓冲液(含30% EtOH和1% Tween)中表现出令人印象印象的NIR-II发射，其最大发射波长(880/940 nm)相对于O-HD (710 nm)红移170/230 nm，肩峰波长延长至1200 nm。然而，化学稳定性试验表明，NIRII-HD1很容易被ROS破坏(HClO和ONOO-)。与O-HD相似，NIRII-HD1在黄蒽环9位的亲核加成和氧化导致其不稳定。因此，作者合成了化合物NIRII-HD2及其酯衍生物NIRII-HD3，它们是NIRII-HD1的衍生物，其黄蒽环的9-位置被苯甲酸或苯甲酸甲酯基团所覆盖。观察到化学稳定性增强，即使存在HClO和ONOO- 1小时后，对NIRII-HD2和NIRII-HD3的吸收基本不变。此外，还需要注意的是，苯甲酸甲酯基团改性后，虽然NIRII-HD3的吸收和发射与NIRII-HD1相同，但其荧光量量子产率(QY)却增加了一倍。这些结果表明，与原始染料NIRII-HD1相比，NIRII-HD3由于其更高的化学稳定性和QY，更适合NIR-II在体内成像应用。
考虑到合适的pKa也是评价羟基取代染料成像性能的重要指标，作者用NIRII-HD3进行了pH滴定实验。与O-HD和NIRII-HD1相似，NIRII-HD3的pKa值较高，约为8.0。但众所周知，生理环境的pH值约为7.4.由于pKa值高，羟基取代染料在生理环境中很难解离，从而降低了荧光敏感性。为了确保NIRII-HD染料主要以脱质子形式存在，并在生理条件下具有良好的NIR-II荧光性能，作者在稳定的高QY染料NIRIIHD3的基础上合成了在羟基正位处安装氯基团的染料NIRII-HD4和NIRII-HD5。正如预期的那样，新NIRII-HD染料的pKa值确实更低，NIRII-HD4和NIRII-HD5的pKa值分别为6.3和6.5。值得注意的是，与NIRII-HD3相比，虽然它们的发射波长变化不大，但由于羟基的解离，新型染料(NIRII-HD4和NIRII-HD5)在含30% EtOH和1% Tween的PBS溶液中的摩尔吸收系数和QY显著提高。结果，NIRII-HD4和NIRII-HD5的亮度比NIRII-HD3高得多(ε×ϕ)。从化学稳定性和光稳定性实验中，作者可以看到染料NIRII-HD4和NIRII-HD5在生理条件下也表现出优异的稳定性，可以实现更长的成像时间。这些数据与作者最初的预期很好地一致，并表明NIRII-HD4和NIRII-HD5染料可以作为NIR-II生物成像应用的优秀荧光团。
此外，作者评估了性能最佳的染料NIRII-HD5用于体内成像的潜力。首先，作者进行了MTT试验，证明NIRII-HD5对细胞存活率没有显著影响。然后，在体内评价NIRII-HD5的细胞毒性。实验组小鼠静脉注射200 μM NIRII-HD5 (100 μL in PBS, pH 7.4，含10% EtOH) 1天，与正常组小鼠相比，实验组小鼠没有出现任何器官损伤。接下来，作者探索了NIRII-HD5在活体深部组织成像的能力，并将其与O-HDs的成像性能进行了比较。NIRII-HD5的图像可以在5毫米深处识别出毛细血管的锐利边缘，而在模拟生物组织(1% Intralipid)中，O-HDs只能在2毫米处检测到。在体内成像中，作者也可以看到，经皮内注射混合溶液后，NIRII-HD5在NIR-II窗口(1000-1700 nm)有清晰的淋巴结成像，其SBR高达10.5。相比之下，O-HDs及其两种类似物在发射通道(695-770 nm, NIR-I区域)显示出微弱的荧光和较差的信反比(SBR <2.4)。在它们的最佳收集通道，每种染料(NIRII-HD5, O-HD及其类似物)在管中混合溶液中发出明亮的荧光。这些结果表明，O-HDs在活小鼠淋巴结的成像性能较差主要是由于NIR-I光穿透组织较弱，而组织背景自身荧光较强，进一步证明了NIRII-HD5由于其NIR-II发射而具有较好的深部组织成像能力。
利用连续激光照射下的淋巴引流成像，研究了NIRII-HD5在体内的光稳定性。860 nm激光照射5 min后，NIRII-HD5仍能清晰区分淋巴结，且NIRII-HD5的荧光强度保持不变。相比之下，在相同通量率下，808 nm激光激发5 min后，ICG大部分发生漂白，仅保留30%的初始发射强度。结果表明，NIRII-HD5具有良好的光稳定性，有利于长时间的体内成像。值得注意的是，照射后5分钟，腘淋巴结的ICG信号恢复，说明小鼠的淋巴管未受损伤，因此小鼠脚底富集的ICG染料可以再次通过淋巴管流向淋巴结。为了进一步证实这一点，作者增加了激光照射后用止血夹堵塞淋巴管的实验。结果显示，与未使用止血夹的对照组相比，ICG的淋巴结信号恢复明显受到抑制。此外，为了研究NIRII-HD5在体内的化学稳定性，作者用具有代表性的染料NIRII-HD5对LPS诱导的淋巴炎症模型活体小鼠进行了NIR-II荧光成像，并与ICG注射小鼠进行了比较。注射60分钟后，作者的新型染料NIRII-HD5在正常和炎症淋巴结中都保持了明亮的NIR-II发射，而炎症淋巴结中的ICG强度比正常淋巴结中降低了一半。这些数据表明，NIRII-HD5适用于活体NIR-II荧光成像，即使在临床病理环境中也是如此。基于以上结果，作者可以确定NIRII-HD5是一种很有前途的NIR-II造影剂。
受到上述结果的鼓舞，作者研究了NIR-II发射染料NIRII-HD5是否可以用作类似于O-HD的通用探针设计平台。基于NIRII-HD5，三种可激活的NIR-II荧光探针NIRII-HD5- GSH, NIRII-HD5-ONOO-、NIRII-HD5-ALP等用于GSH、ONOO-，和ALP活性。作者选择了这三个成像目标，因为它们代表了三种不同类型的分析物(ROS，硫醇和酶)，同时在各种生物过程中也很重要。比如GSH和ONOO-是维持体内平衡的重要分子，它们的波动经常引起许多疾病，如炎症、癌症和神经退行性疾病此外，碱性磷酸酶已被用作识别癌细胞和组织的标记物。
在体内使用NIR-II生物成像之前，作者研究了三种新开发的NIR-II可激活探针的体外分析物。探针NIRII-HD5-ONOO-与原始染料NIRII-HD5 (λabs= 854 nm)相比，808 nm激光激发后不仅几乎没有荧光，而且出现了明显的蓝移吸收峰(λabs = 723 nm)。然而，随着ONOO-的加入在PBS缓冲液(pH 7.4，含30% EtOH和1% tween-80)中，854 nm处的吸收强度和895/936 nm处的强发射峰显著增强。选择性实验表明，NIRII-HD5-ONOO-对ONOO?高于其他生物物种，这表明它可以作为ONOO-的高效荧光探针检测。同样，在PBS缓冲液(含30% EtOH和1% Tween-80)中，GSH也能有效激活NIRII-HD5-GSH探针。在1.4 mM GSH存在的情况下，NIRII-HD5-GSH在895 nm处的荧光峰值显著增强，而在加入其他生物物种后，其荧光变化可以忽略不计。最后，作者确定NIRII-HD5-ALP保留了对ALP的响应性。类似于探测器NIRII-HD5-ONOO-和NIRII-HD5-GSH，探针NIRII-HD5-ALP也表现出ALP依赖反应和优异的选择性。值得注意的是，由于磺酰基的吸电子能力较强，探针NIRII-HD5-GSH和NIRII-HD5-ONOO-与NIRII-HD5-ALP相比，NIRII-HD5-ALP具有较短的吸收(692 nm和723 nm)和较弱的背景荧光。结果表明，探针NIRII-HD5-GSH的荧光增强(增强29倍)和NIRII-HD5-ONOO-(16倍增强)的分析检测效果远高于探针NIRII-HD5-ALP(6倍增强)。总的来说，这些结果表明，与原始染料O-HD类似，新型染料NIRII-HD5可以用作设计用于NIR-II传感的可激活荧光探针的有效平台。
为了证明NIRII-HD5衍生探针在体内荧光检测的能力，NIRII-HD5-ONOO-首次用于检测ONOO-在脂多糖(LPS)皮内注射(i.d.)诱导的淋巴炎症小鼠模型中。与盐水处理的对照组相比，LPS诱导的实验组在NIRII-HD5-ONOO-后，腘和坐骨淋巴结均显示出明显的亮度。特别是，与对照组相比，LPS组在探针注射30 min后腘淋巴结的信号增加了约2倍。这一结果表明LPS确实可以诱导淋巴结炎症，并探测NIRII-HD5-ONOO-可以用来成像这个过程。进一步，作者测试了NIRII-HD5-ALP通过ALP活性来区分正常组织和肿瘤组织的能力。当NIRII-HD5-ALP探针注射到小鼠体内时，肿瘤部位的NIR-II荧光强度在约8 h时最强，而正常组织在同一时间内表现为微弱且几乎恒定的荧光强度。这些数据表明NIRII-HD5-ALP可用于体内癌症检测。
此外，作者使用NIRII-HD5-GSH探针研究癌细胞在淋巴转移中的扩散情况。众所周知，癌细胞的谷胱甘肽水平比正常细胞高得多(高达10毫米)，它们通常通过淋巴管从原发肿瘤转移到远处的器官因此，为了可视化和跟踪实体瘤的淋巴转移，作者通过GSH特异性反应探针检测淋巴管中GSH的波动。将NIRII-HD5-GSH注射到4T1荷瘤小鼠的左右后爪(500m mm3)，在肿瘤侧(右侧)的腘和坐骨淋巴结观察到令人眩目的NIR-II荧光，而正常侧(左侧)的淋巴结则表现出微弱的荧光。相比之下，在正常小鼠(无荷瘤小鼠)两侧淋巴结中检测到几乎相同的微弱荧光信号。量化平均强度显示肿瘤侧腘窝和坐骨淋巴结区域信号比正常侧高3倍，说明癌细胞确实通过淋巴发生了代谢迁移。免疫组化分析(IHC)检测正常侧和肿瘤侧腘窝、坐骨淋巴结CD206水平如图所示，CD206过表达，可见组织切片上大面积的染色区域，表明肿瘤细胞已经转移到小鼠淋巴结。这些结果证实了由NIRII-HD5衍生的新型NIR-II探针可以作为一种有效的体内疾病诊断工具。
对乙酰氨基酚(APAP)因其镇痛解热的特性而成为最常用的药物之一。然而，APAP过量可导致严重的肝毒性，已成为许多国家的主要问题有报道称APAP一般在肝脏中经过酶促生物转化产生N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)， NAPQI可被谷胱甘肽(GSH)快速还原然而，APAP过量后，过度生成的NAPQI消耗GSH，导致直接与细胞蛋白结合。因此，线粒体功能受到干扰，释放出大量ROS(如ONOO-)，引起肝脏损伤。此外，N -乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种保肝药物，具有抗氧化能力，可以通过产生GSH来抵消APAP诱导的肝脏氧化应激，从而维持ONOO-/GSH在小鼠中的产生。在上述结果的鼓舞下，作者研究了NIRII-HD5探针(NIRII-HD5- GSH和NIRII-HD5- ONOO-)是否可以通过NIR-II成像在体内监测这一过程。经生理盐水处理的正常Balb/c小鼠在给予NIRII-HD5-GSH后，肝脏显示出高荧光。但是，预处理后用300mg kg-1 APAP作用12小时后，小鼠肝脏中NIR-II荧光显著降低。相比之下，探测器NIRII-HD5-ONOO-在药物刺激前后，小鼠肝脏呈现相反的荧光变化。这些结果表明，随着药物性肝毒性的发生，小鼠肝脏GSH减少，肝组织中ROS (ONOO-)显著增加。值得注意的是，如果给小鼠预处理300mgkg-1与仅接受APAP (300 mgkg-1)的小鼠相比，NIRII-HD5-GSH的荧光显著增强，NIRII-HD5-ONOO-被观察到。这一结果表明NAC确实可以作为APAP毒性的解药，并进一步证明了这些基于NIRII-HD5的NIR-II探针在体内肝毒性成像中的有效性。此外，作者还从组织学分析中确定了这些肝组织的不同组织学变化。总的来说，得益于平台的便利，作者首次使用NIR-II成像技术可视化了APAP诱导的肝损伤中ROS (ONOO-和GSH)的波动。
结论
综上所述，作者设计并合成了一系列具有光学可调羟基的NIR-II染料(NIRII-HD1-5)。其中，NIRII-HD5表现出最佳的光学性能，如适当的pKa、良好的稳定性和较高的NIR-II亮度，可作为开发可激活NIR-II探针的新平台。为了证明其多功能性，作者还开发了一系列荧光探针(NIRII-HD5-GSH, NIRII-HD5-ONOO-和NIRIIHD5-ALP)，只需一步修饰NIRII-HD5染料的羟基。实验结果表明，这些新型NIR-II探针不仅在体外对相应的分析物表现出优异的响应性和选择性，而且在体内成功实现了疾病的可靠检测。作者乐观地认为，NIRII-HD染料将成为未来NIR-II领域广泛采用的荧光探针平台。
参考文献
NIRII-HDs: A Versatile Platform for Developing Activatable NIR-II Fluorogenic Probes for Reliable In Vivo Analyte Sensing. Zuojia Qin,Dr. Tian-Bing Ren, Huijie Zhou, Xingxing Zhang, Long He, Zhe Li, Prof. Xiao-Bing Zhang, Prof. Lin Yuan. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202201541. https://doi.org/10.1002/anie.202201541
