内容提要
在900-1700nm区域具有光谱活性的小分子有机荧光团具有可调波长和传感特性，是体内光学成像和生物传感的理想材料。为了应对这一挑战，作者开发了一种新的荧光染料（C X）。CX染料具有菁染料波长可调的优点，并具有刚性聚甲酰胺链以保证其稳定性。它们在水生理环境中表现出良好的化学稳定性和光稳定性，光学性质可调，最大吸收/发射波长为1089/1140nm。它们在高对比度活体生物成像和多色检测方面显示出巨大的潜力。在深层组织下证明了CX染料之间的Förster共振能量转移（FRET）过程，这为通过检测OONO-来监测药物诱导的肝毒性提供了一种方法。本报告提出了一系列新的NIR-II染料，具有良好的光谱特性，用于高对比度生物成像和多路生物传感。
研究了CX染料在不同溶剂中的光物理性质。CHCl3中CX-1、CX-2和CX-3的最大吸收/发射波长分别位于883/920 nm、981/1032 nm和1089/1140 nm。随着共轭链由两个碳原子增加，观察到约100 nm的吸收和发射波长的深变色位移。在各种溶剂中，它们的摩尔消光系数约为1 x 105 cm-1M-1。它们在极性非质子溶剂氯仿中的荧光量子产率为0.66±0. 03%, 0. 45±0. 02%和0.091±0. 014%。
将CX染料的化学稳定性与市售IR 26进行了比较。首先，作者测量了CX染料和菁染料在氯仿和水溶液（50% MeCN）中的光谱。与它们在氯仿中的吸光度相比，CX染料在水溶液中的吸光度下降了7-62%，IR 26下降了91%。同时，水溶液中的C X染料在用氯仿萃取后可以回收，但IR 26几乎不能。随后，还评估了C X染料对生物亲核试剂和活性氧的化学稳定性。CX染料没有明显的光谱变化。在中性条件下，添加谷胱甘肽、半胱氨酸、硫化氢、过氧化氢、过氧亚硝酸盐或次氯酸盐（OCl-）至其相应的生理浓度后观察到PBS。此外，深入研究了C X染料在酸碱环境下的化学稳定性。以CX-1为例，除非pH值超过12或低于3，否则吸收光谱保持不变。
以临床批准的ICG为参考，研究CX染料的光稳定性。ICG溶液、CX-1、CX-2和CX-3在相应的连续激光下以0.5 W/cm2的注量率辐照。将每种染料在辐照波长下的吸光度设置为相同。50分钟后，ICG的荧光强度下降了约99%，但CXs的荧光强度仅下降了1-10%，这表明CX染料比ICG更具光稳定性。
为了探索这些稳定的CXs用于NIR-II生物医学成像的潜力，在细胞系Raw 264.7中通过CCK8测定C-X染料的细胞毒性。100℃孵育后用C X-2在裸鼠体内进行淋巴引流的荧光成像（用于成像的所有CX染料都装载在胶束中。CX-2是CX中NIR-II区域最亮的）。在裸鼠后爪皮内注射CX-2，10分钟后获得荧光图像。从高倍图像中可以清楚地分辨出小鼠后肢踝关节中至少3条拥挤的侧支淋巴管。侧支淋巴管的横截面强度分布显示最大特征分辨率（半高宽）为0.48毫米，信号背景比（SBR）为17.4。这些结果清楚地表明，CX染料是理想的NR-II荧光显像剂，用于体内成像。
接下来，在淋巴引流成像期间，通过在稳定的NIR-II信号时间窗口内连续激光照射，验证了CX染料在体内的光稳定性。长时间激光照射（965 nm，50 min）后，血管和淋巴结仍能清晰区分。相比之下，在808 nm激光照射6分钟后，ICG在相同的注量率下几乎完全光漂白。值得注意的是，淋巴结信号在照射后20分钟内恢复，表明丢失的信号是由ICG的光漂白而不是淋巴管损伤引起的。这些结果进一步证实，CX染料比ICG更具光稳定性（对于CX-1，CX-3），这将有利于体内荧光成像。
CX染料的多波长可调谐性和良好稳定性的优点促使作者探索其在体内多色成像中的潜力。毛细管分别装载CX-1、CX-2和CX-3，并排放置在培养皿下。使用不同的激发波长和相应的滤光片，可以在高达4 mm的组织深度上清楚地区分三个毛细血管。接下来，作者在离心管中同时成像CX染料的混合物和单独溶液。成像结果证实，来自混合物的信号与相应染料的信号一致，这排除了用于多色成像的CX染料之间的光串扰。在注射CX染料后立即获得体内图像。对于重叠成像区域，可以清楚地区分三个光学通道，这使作者能够同时利用多路信息探测深层组织。
第二个近红外窗口中的荧光成像使作者能够以更高的分辨率探测深层组织，同时更迫切地需要实现深层组织生物传感。由于发射光谱和吸收光谱重叠的特点，作者试图研究CX染料之间通过FRET过程对NIR-II荧光的可能操纵。用808 nm激光激发含有CX-1和CX-3或仅含有CX-1或CX-3的胶束。CX-3的发射强度增加，CX-1的强度明显降低，表明CX-1和CX-3之间发生了有效的FRET过程。作者进一步记录了850-1100 nm和>1100 nm处的荧光信号，作为组织深度的函数，结果与它们在4 mm深度处的发射光谱完全一致。这无疑表明了通过深部组织的FRET调节NIR-II荧光的可能性。
CX染料良好的稳定性和高效的FRET过程激发了作者探索无创深部组织活体检测的可能性。药物毒性是现代医学长期关注的问题。由于肝脏是大多数药物的主要代谢器官，药物引起的肝毒性是导致药物未获批准和上市后停药的唯一最重要原因。例如，醋氨酚（APAP）是一种常用的家用药物，用于治疗疼痛和发烧，众所周知，在某些人群中会引起严重的肝毒性。因此，精确的体内肝毒性成像可以改进药物设计和肝毒性修复处方的选择。有人提出，活性氮物种（RNS）的产生是肝毒性的早期迹象。特别是，OONO-被认为是药物诱导肝毒性的直接生物标志物，而在体内检测OONO-浓度仍然是一个挑战。
在目前的工作中，作者发现CX-1比CX-3对OONO-更稳定。CX-1和CX-3对OONO-的反应性和反应速率存在明显差异。当OONO-浓度设定在相同水平时，CX-1的反应速率远低于CX-3。根据理论密度泛函理论（DFT）计算，CX-3的HOMO能级远高于CX-1，这可以用来解释为什么CX-1比CX-3更稳定，因为HOMO的能量与氧化电位有关。然后，作者通过简单地将CX-1和CX-3加载到胶束中来构建用于OONO-检测的荧光探针PN 1100。在808 nm激光激发下，PN 1100在约920 nm处显示弱发射峰，在约1130 nm处显示相对强发射峰，分别对应于CX-1和CpX-3的发射峰。经OONO-处理后，920 nm处的发射峰稳步增加，而1130 nm处的发射峰稳步下降，F920/F1130的比值保持指数增长，这表明CX-3逐渐被OONO-氧化，CX-1和CX-3之间的FRET过程被破坏。此外，PN 1100的F920/F1130比值信号几乎不受GSH、半胱氨酸、H2O2、ClO等生物物种的干扰。因此，这是一种可靠的OONO-检测方法，因为比率信号是基于FRET的自校正结果。
有了这些数据，作者进一步研究了以APAP处理的小鼠为模型，用PN1100在体内检测药物诱导的肝毒性。将雌性裸鼠随机分为三组，分别用磷酸盐缓冲液（PBS）、APAP和APAP N-乙酰半胱氨酸（NAC，一种用于治疗醋氨酚过量的通用药物）治疗。在注射PN 1100后不同时间记录肝脏的950 nm LP和1100 nm LP荧光信号。950LP/1100LP的比率图像清楚地表明，由于该比率明显高于PBS组和修复（APAP-NAC）组，所以APAP处理的小鼠的肝脏中产生OONO-。510m基于比率信号计算，可以检测APAP处理小鼠中的OONO-浓度（300 mg/Kg）。最后，作者对成像后的小鼠肝组织进行了组织学分析（苏木精和伊红染色（H&E）。APAP治疗组观察到肝细胞形态不均匀和炎性细胞浸润（箭头2）。NAC治疗组的症状明显改善，但仍可以观察到少量炎性细胞浸润，这表明NAC可以有效抑制APAP诱导的肝损伤。这些组织学结果与体内荧光成像的观察结果一致。
总结
总之，CX系列有机荧光团可用于高达4 mm的体内多色成像。此外，通过调节CX染料的波长制备了基于FRET的荧光探针，该探针显示了针对OONO-的可靠信号变化，并成功应用于APAP诱导的肝毒性的体内检测。作者相信，通过深部组织的FRET调节NIR-II荧光将成为NIR-II荧光传感探针设计的一般策略。此外，CX染料具有良好的光谱特性和简便的合成方法，可用于基于光谱的生物医学和材料应用。同时，CX染料仍有一些局限性。例如，它们的斯托克斯位移（约40-55 nm）相对较短。因此，未来的工作将侧重于具有更大斯托克斯位移的类似物的开发，以及基于FRET的应用。
参考文献
Stable, Wavelength-Tunable Fluorescent Dyes in the NIR-II Region for in-vivo High-Contrast Bioimaging and Multiplexed Biosensing. Zuhai Lei, Caixia Sun, Peng Pei, Shangfeng Wang, Dandan Li, Xin Zhang, and Fan Zhang. Angew Chem Int Ed Engl 2019, 58 (24), 8166-8171. http://dx.doi.org/10.1002/ange.201904182
