内容提要
癌症免疫疗法在肿瘤根除和转移抑制方面具有巨大潜力。然而，免疫佐剂的全身给药和癌症治疗的特异性不足，导致临床环境中治疗益处受限和潜在的免疫相关副作用。在本报告中，优化了各种长度的七次甲基花青小分子的合成，作为多功能光敏剂(PS)，用于肿瘤特异性积累、近红外(NIR)荧光成像和光动力/光热/免疫疗法。特别是，证明了在两个N-烷基侧链上包含八个碳的C8可有效地与白蛋白自组装形成纳米级染料-白蛋白复合物。这一特性促进了C8在体内的自组装，显着提高了其水溶性、近红外荧光发射、长期血液循环以及肿瘤特异性积累。更重要的是，C8不仅对原发性肿瘤表现出优异的光疗作用，而且还引发损伤相关分子模式的分泌、细胞因子分泌、树突状细胞成熟和细胞毒性T淋巴细胞活化，最终引发足够的抗肿瘤免疫反应来抑制远处的生长。和转移性肿瘤。因此，这种多功能小分子PS具有优异的肿瘤优先积累、成像引导的激光照射和光疗诱导的原位抗肿瘤免疫反应等特点，为其在肿瘤靶向免疫治疗中的应用提供了广阔的前景。
结果与讨论
首先，作者合成了不同的七次甲基花青小分子（命名为C3-C11），包含不同长度（3-11个碳）的N-烷基侧链，基于早期报道的协议。作者进一步表征了它们的结构通过1H NMR和高分辨率质谱。测量了二甲基亚砜(DMSO)、磷酸盐缓冲液(PBS)和10 %胎牛血清(FBS)中C3–C1的光学特性。所有七次甲基花青在700-900 nm范围内均显示出最大的近红外光谱吸收和发射波长，包括高摩尔吸收系数和荧光量子产率(FQY)。值得注意的是，它们的FQY高于吲哚菁绿(ICG)，这是临床上唯一获批的在NIR激光照射下显示PDT和PTT效应的七甲基菁染料。此外，ICG是一种非特异性七甲基菁染料，可快速清除身体（半衰期：150-180 s）通过肝脏代谢，从而限制其体内光疗效果。已证明光敏化效果与摩尔吸收系数、脂水分配系数（log P）、极化率、PS的灵活性和灵活性。基于光学测定和分子计算，不同长度的七次甲基花青的摩尔吸收系数不同（10 100–245 500 mol−1cm− 1）、疏水性（log P = 4.10-10.34）、非极性表面积（275.38-600.27）和可旋转键（9-25），为高效光疗提供不同的候选优化。将所有新合成的花青光敏剂溶解在DMSO (10 mm)中，并在-20 °C下储存备用。作者使用紫外吸收光谱研究了他们的DMSO储备溶液的稳定性。在放养超过60天后，它们都非常稳定，没有明显的降解。
接下来，作者检查了不同长度的七次甲基花青（C3-C11）与白蛋白的自组装能力。将C3–C11分别添加到1%人血清白蛋白(HSA)溶液中后，携带8个碳原子的C8通过自组装形成约20 nm的球形纳米颗粒，透射电子显微镜(TEM)证明了这一点。通过动态光散射测试C8-白蛋白自组装复合物的平均流体动力学直径为51.9 nm。C10也表现出形成球形纳米颗粒，但具有粗糙表面和多种尺寸。除了C8和C10，其他类似物没有形成不同的纳米颗粒。结果表明，末端带有适当长度和水溶性羧酸基团的长N-烷基链可以促进自组装。接下来通过荧光光谱测定证C3-C11和HSA之间的不同相互作用。由于C3-C11在有机溶剂中的均匀分散，MeOH中C3-C11的荧光强度没有明显差异。当N-烷基链的长度增加时，它们的荧光强度在水溶液中逐渐降低。它可能是由于水溶液中聚集诱导的荧光猝灭引起的，这在许多传统的花青染料中很常见。相比之下，它们的荧光强度随着HSA浓度从0.1 %增加到5 %的增加而上升，验证了七次甲基花青和白蛋白之间现有的相互作用。特别是，在所有类似物中，C8的荧光强度增加最为显着，即使在相对低浓度的0.1% HSA中也是如此。当将不同的类似物添加到0 %至10 % FBS中时，观察到类似的趋势，表明C8和血清白蛋白之间的相互作用最强。使用不同的竞争性抑制剂，即布洛芬、华法林、地高辛和奎尼丁来评估C3-C11的白蛋白结合位点。根据作者的结果，一旦血清白蛋白与布洛芬预混合，C8荧光显着降低持，表明C8在布洛芬相互作用位点与白蛋白结合。C8在布洛芬相互作用位点与HSA的3D分子对接表明适当的长度有助于C8的末端羧酸基团和HSA的碱性精氨酸残基之间形成氢键。在这种特定的结构构象中，七甲碱核中的C8吲哚环也可能有助于与含有吲哚的HSA色氨酸残基形成氢键。事实上，与其他类似物相比，C8在布洛芬相互作用位点与HSA对接期间表现出最低的结合能（-10.8 kcal mol-1）。相应地，最高的C8白蛋白结合能力可能介导自组装的最大功效。作者测定了将10 µm C8添加到0–80 µm的HSA水溶液中后的吸收光谱。结果表明，当摩尔比（染料：HSA）为或大于1时，吸收强度达到饱和。因此，纳米级染料-白蛋白自组装可能在几种有机染料和几种HSA (1:1)之间介导。
为了检查C3-C11与白蛋白的体内自组装，在静脉注射后评估了它们在携带4T1的肿瘤异种移植物中的肿瘤靶向能力。体内和体外近红外荧光成像均显示C8在所有类似物中显示出最高的对比度指数。同时，根据体内近红外成像，C8表现出最强的荧光强度和最长的血液循环。C8的有利体内特性可能归因于血液中丰富的白蛋白，以及C8和白蛋白之间的高效自组装。纳米尺寸的自组装可以通过增强的渗透性和保留效应促进被动靶向。基于该类肿瘤靶向七次甲基花青染料的OATPs机制和白蛋白介导的药物靶向递送的FcRn机制，推测这两种膜受体可能参与肿瘤细胞对其自组装复合物的主动摄取是合理的。
为了比较不同类似物的PDT功效，在808 nm激光照射下用单线态氧传感器绿色(SOSG)测定单线态氧(1O2)。结果显示，C8诱导了最大的1O2生成。同时，测定不同类似物的温度升高以比较PTT功效。同样，C8也引起了最高的温度升高（ΔT≈25），并在5分钟激光照射后保持在50 °C以上。在不同的浓度和不同的辐照功率下也发现了C8的显着发热，因此显示出高PTT功效。根据报道的方法，自组装前后的ROS产量分别计算为0.37和0.38。ROS生成似乎没有明显变化。然而，自组装前后的光热转换效率分别计算为10.6 %和52.8 %。这些发现不仅进一步证明了C8-白蛋白自组装的强相互作用和重要性，而且揭示了自组装主要改善了C8的PTT效应。
研究了C8对4T1肿瘤细胞系的光疗作用。流式细胞仪分析表明，C8被4T1细胞迅速吸收，并在12小时后达到最大含量。对4T1细胞中的亚细胞定位分析表明，C8以及其他类似物特异性地积聚在肿瘤细胞的线粒体中，并与线粒体跟踪器共定位。线粒体是细胞的动力源，已被公认为与肿瘤生长、进展和免疫逃逸密切相关。因此，通过靶向线粒体，C8介导的光疗可以有效地杀死肿瘤细胞。正如预期的那样，C8在激光照射下表现出强大的光疗效果，而未照射的细胞活力没有明显变化。同样，在C8与MCF-10A人正常乳腺细胞暗温孵育后，细胞活力没有明显变化。使用calcine AM和碘化丙啶(PI)共同染色的4T1细胞的荧光图像进一步验证了有效的C8光疗法，这些细胞分别对活细胞和死细胞进行染色。当用 N-乙酰半胱氨酸（抑制PDT效应）或冰孵育（抑制PTT效应）预处理时，总细胞活力分别增加了≈20 %和≈40 %。照射6小时后，对4T1细胞中的ROS生成进行成像，发现其显着增加。Western印迹显示热休克蛋白90（HSP90）高表达，这是一种典型的高温标志物。以上所有结果验证了C8的体外双模态PDT/PTT效应。
为了评估体外C8光疗引发的抗肿瘤免疫反应，检测了作为IC的两个关键指标的钙网蛋白(CRT)的表达和高迁移率group box-1 (HMGB1)的释放。4T1的免疫荧光染色表明，仅在C8照射组中观察到细胞表面CRT（绿色荧光）的高表达水平。同时，仅在C8照射组中，4T1细胞内的HMGB1（红色荧光）水平显着降低，因为在C8介导的光疗后HMGB1被激活从细胞核释放到细胞外环境。它们都可以发出“吃我”的危险信号，刺激未成熟的DC和巨噬细胞吞噬垂死的肿瘤细胞，从而增强抗原呈递并激活T细胞。为了进一步验证光诱导的免疫原性效应，采用了transwell系统。经过不同处理后，将4T1肿瘤细胞接种到transwell系统的上室中，并在下室中接种DC。在不同处理20小时后通过流式细胞仪分析DC成熟。与对照组（未处理的4T1细胞）、激光或C8组相比，C8照射组诱导的成熟DC（CD11c+CD86+和CD11c+CD80+）比例明显更高。使用相同的transwell系统，作者还测量了DC分泌的免疫相关细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6)和白细胞介素12 (IL-12p70)，它们是DC的已知标志物激活，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）。根据作者的分析，在C8照射4T1细胞后，来自DC的TNF-α、IL-6和IL-12p70分泌物显着升高。这表明使用C8进行光疗可以引发强烈的免疫反应。
基于作者对体外PDT/PTT/免疫治疗对肿瘤细胞的深远影响的观察，作者继续对带有4T1的肿瘤异种移植物的单个肿瘤模型进行体内评估。不同剂量的C8（0、1.5和2.5 mg kg-1）通过小鼠尾静脉给药。在体内近红外成像引导下，在C8给药后24小时对肿瘤进行808 nm激光照射，功率密度为0.8 W cm-2。在激光照射期间，2.5 mg kg-1 C8给药小鼠的肿瘤区域温度在激光照射5分钟后逐渐升至50 °C。每3天记录每组的肿瘤体积。根据作者的结果，2.5 mg kg-1C8照射的小鼠能够在12天后有效地抑制肿瘤生长，而单独的C8或激光照射治疗没有发现明显的抗肿瘤作用。在处死这些小鼠后，切除所有肿瘤并称重。结果与肿瘤体积一致。为了阐明体内光疗是否引发了强烈的抗肿瘤免疫反应，提取了肿瘤引流淋巴结和相关肿瘤用于DC成熟的流式细胞术分析。相对于对照小鼠，来自C8照射小鼠的肿瘤引流淋巴结中成熟DC（CD11c+MHC II+）的数量增加了2.2倍。同时，相对于对照小鼠，来自C8照射小鼠的原发性肿瘤中CD3+CD8+T细胞的数量也增加了1.7倍。作者还在特定治疗后3天测定了免疫相关细胞因子如TNF-α、IFN-γ和IL-12p70的水平。在C8辐照处理后，所有三种细胞因子均显着升高。此外，由于脾脏是体内最大的免疫器官，作者对脾脏细胞中的T细胞和亚群进行了流式细胞术分析。作者的结果显示，相对于对照小鼠，来自C8照射小鼠的脾细胞中CD3+ T细胞的数量增加了1.8。更令人印象深刻的是，相对于对照组，如果与T淋巴细胞激活剂（如佛波醇12-肉豆蔻酸酯13醋酸酯（PMA）。然而，值得注意的是，C8光疗不会引起过度炎症或引起脾肿大，正如在荷瘤小鼠中发现的那样。相反，与不同治疗组的脾脏大小相比，C8光疗可以将肿瘤相关的脾肿大缓解至正常，与健康小鼠相似。因此，C8介导的光疗可以有效杀死肿瘤细胞，适度促进免疫相关细胞因子释放，有效引发抗肿瘤免疫反应。
在带有原发性和远处肿瘤的小鼠模型上评估了C8的光疗触发的免疫治疗功效。第二个肿瘤是在第一个肿瘤植入后的第7天种植的，也是在静脉注射C8后24小时。随后，对第一个肿瘤进行激光照射，然后对原发性和远处肿瘤进行生长测量。单独接受激光照射或未接受C8照射的小鼠中的肿瘤体积与注射PBS的对照相当，因此表明单独接受C8或激光照射的抗癌治疗功效可忽略不计。相比之下，C8照射小鼠中原发性和远处肿瘤的生长均得到有效抑制，因此6只小鼠中有2-3只小鼠基本上没有肿瘤。处死小鼠后，称量各组肿瘤重量。结果的趋势与其各自的肿瘤体积一致。苏木精和伊红(H&E)和Ki-67染色显示C8照射组远处肿瘤的肿瘤组织受到严重损伤，肿瘤细胞生长增殖率低。在治疗期间，作者监测了不同组的小鼠体重，没有观察到显着变化，表明没有C8引起的一般毒性。在40天的小鼠存活观察期间，作者发现C8照射处理的小鼠存活率为100 %。
转移是癌症治疗中临床治疗失败的一个重要因素。为了研究C8对远处转移瘤的免疫治疗作用，将4T1细胞静脉注射到携带4T1的BALB/c小鼠中以建立肺转移瘤模型。给予2.5 mg kg-1的C824小时后，对皮下种植的4T1肿瘤进行局部光疗，然后在第21天评估肺转移。根据作者的结果，C8照射的小鼠几乎没有肺转移性病变，而其他治疗组有大量肺转移。这些证据证实了C8光疗法对转移性肿瘤的有效抗肿瘤免疫治疗作用。为初步评价C8的生物相容性，用不同浓度的C8处理3 h后进行溶血分析。结果显示没有发生明显的溶血（水解率< 1%；）。为了进行体内毒性评估，作者在正常小鼠中给予2.5、5和10 mg kg-1C8，并在14天后处死小鼠，使用H&E染色分析主要器官。相对于对照器官，作者没有观察到任何器官的明显损伤，表明C8在抗肿瘤治疗期间具有良好的生物相容性。
结论
总之，合成了不同长度的七次甲基花青小分子C3-C11，以优化适合白蛋白结合和自组装的结构构象。简单混合后，发现所有类似物中的C8可有效地与白蛋白自组装形成纳米级染料-白蛋白复合物。相应地，根据荷瘤小鼠的体内近红外成像，C8也表现出最强的荧光强度、最长的血液循环和最佳的肿瘤靶向能力。C8的有利特性可能归因于血液中丰富的血清白蛋白，以及C8和白蛋白之间的高效自组装。体内自组装将显着改善C8水溶性、近红外荧光发射、长期血液循环以及肿瘤特异性积累。更重要的是，自组装可以显着放大C8的PDT/PTT 效应，从而引发足够的抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制原发性、远处和转移性肿瘤的生长。因此，这种多功能小分子PS具有化学合成成本低、肿瘤优先积累、PDT/PTT双模式高效治疗原发性肿瘤、原位激活抗肿瘤免疫反应等优点，无需系统给药任何其他免疫治疗药物。在肿瘤靶向治疗的应用中具有很大的前景，并且副作用最小。
参考文献
Tailoring Multifunctional Small Molecular Photosensitizers to In Vivo Self-Assemble with Albumin to Boost Tumor-Preferential Accumulation, NIR Imaging,and Photodynamic/Photothermal/Immunotherapy. Shenglin Luo, Xi Luo, Xiaojiao Wang, Lian Li, Huiguo Liu, Banghui Mo, Hongbo Gan, Wei Sun, Liting Wang, Houjie Liang, Songtao Yu.Small2022, 22012. https://doi.org/10.1002/smll.202201298
