内容提要
通过改变配体L的性质，合成了5种锇(II)聚吡啶配合物[Os (4,7-二苯基-1,10菲咯啉)2L]2+作为光敏剂用于光动力治疗。由于配体的明显π扩展结构和锇中心提供的重原子效应，这些配合物在近红外(NIR)区域(高达740 nm)表现出较高的吸收，不同于相关的钌配合物。这使得在体外对2D细胞层培养的癌细胞具有很好的光毒性，而且在740 nm照射下对多细胞肿瘤球体也具有光毒性。复合物[Os(4,7-二苯基-1,10-菲罗啉)2(2,2 ' -联吡啶)]2+对各种癌细胞系的抑制效果最好，具有较高的光毒指数。在CT26荷瘤BALB/c小鼠上的实验也表明，在740 nm激光照射下，Os(II)配合物可以显著抑制肿瘤生长。这种结构简单的复合物在生物窗口中的高光毒性使其成为治疗癌症的有前途的光敏剂。
结果与讨论
合成与表征
二氯锇配合物Os(DIP)2Cl2的合成在以前的工作中已经报道过，但没有详细的表征。然而，在重复上述过程时防止副产物[Os(DIP)3]2+的形成似乎具有挑战性。经过几次硅胶色谱纯化尝试后，通过乙醇/丙酮混合物(50:1)(v/v)中的丙酮沉淀成功地从副产物中分离出前驱体配合物。除了dnbpy，所有配体都是市售的，dnbpy是先前报道合成的通过在脱气乙二醇中与相应配体在90℃下加热前体复合物得到最终化合物。详细的程序和特性在辅助信息中提供。通过1H和13C核磁共振波谱和高分辨率质谱确认了所有配合物的结构，并通过元素分析和高效液相色谱(HPLC)评估了其纯度。配合物4和5分别通过乙醚在丙酮或乙腈(CH3CN)中的缓慢扩散分别成功结晶。进行了单晶x射线衍射研究晶体数据、结构细化参数和分子结构在支撑信息中以及图2和图3中都有提供。对于配合物4，Os原子通过N原子以扭曲的八面体几何形式配位到两个邻菲罗啉配体和一个取代邻菲罗啉配体。对于配合物5，Os通过N原子以扭曲的八面体几何配位到三个邻菲罗啉配体。
光物理性质
记录了不同聚吡啶配合物的紫外可见光谱，研究了它们在理想光疗窗口(即600-850 nm)内的电子行为。作者注意到前体的基线可能由于纳米颗粒的形成而不理想。配合物1-5的吸收光谱显示240~840nm的全色吸收。所有五种配合物都表现出相似的特征，表明化合物之间的电子跃迁、基态和激发态在性质上是相似的。然而，它们的光谱不同于它们的前体Os(DIP)2Cl2。配合物1-5表现出三个主要的吸收带，通常在相关的配合物被观察到。在280nm处有一个尖锐而强烈的峰，可归因于DIP的IL ππ*跃迁，两个宽峰(最大值分别在约450和500 nm)归因于金属到配体电荷转移(MLCT) Os(dπ)-配体(π*)，最后是覆盖650-750 nm区域的较弱宽带。后者可以用禁自旋MLCT跃迁来解释，这是由于PS的直接单态-三重态跃迁引起的。这些跃迁可以用锇的强自旋-轨道耦合来解释，经常在重原子中遇到最近报道的[Os(phen)3]2+和[Os(DIP)3]2+的类似结果证实了作者的假设。因此，与钌不同，这些配合物在波长大于595 nm的照射下具有潜在的光毒性。
单线态氧(1O2)是PS通过II型机制工作的主要有毒物质。因此，在CH3CN和磷酸盐缓冲硫酸盐(PBS)中，用两种方法定量评估了PSs辐照后单线态氧的产生。作为一种间接方法，在光敏剂和咪唑作为1O2清除剂的存在下，对亚硝基二甲苯胺的吸光度下降被监测为辐照时间(450 nm)的函数。通过对1O2弛豫所产生的特征发光的定量分析，采用直接法对间接法得到的结果进行了验证。然后分别以[Ru(bpy)3]Cl2和phenalenone为参考，在PBS和CH3CN中计算单线态氧量子产率。
两种方法都表明，除3外，所有配合物都能有效敏化氧气，在曝气CH3CN中量子产率为35-50%，在曝气PBS中为2.6-6.2%，表1。配合物3的低产率可能是由于二胺基团的存在，它能够淬灭单线态氧，如前所述。猝灭机理是由于含氮化合物基态与单线态氧之间的电荷转移在水介质中的量子产率低于CH3CN。水介质中单线态产氧量低可能与水的强猝灭特性有关遗憾的是，在氘化水D2O中，由于发光信号低于检测限，直接法无法测定单线态产氧率。
尽管在极性水介质中产生1O2的产量很低，但这些化合物仍然可以证明是有效的PSs，因为细胞包括极性环境。事实上，先前已经证明，在与细胞的疏水成分(如DNA)相互作用后，在水中产生低水平1O2的PSs可以有效地敏化分子氧。
光毒性
为了评估合成复合物的(光)细胞毒作用，对宫颈癌细胞(A2780)和非癌性视网膜色素上皮细胞(RPE1)进行了筛选。为此，细胞与0.1、1或10 μ M的化合物1-5在黑暗中孵育4小时。洗净后，分别在620 nm(光谱半宽:32 nm, 60 min, 1.88 mW cm−2,6.7 J cm−2)、645 nm(光谱半宽:32 nm, 60 min, 2.50 mW cm−2,9.0 J cm−2)、670 nm(光谱半宽:32 nm, 60 min, 3.75 mW cm−2,13.5 J cm−2)、740 nm(光谱半宽:32 nm, 60 min, 3.50 mW cm−2,12.6 J cm−2)下照射1 h。2天后用荧光法测定细胞活力。这项研究使用临床批准的PDT光敏剂原卟啉IX (PpIX)作为对比。第一次筛选表明，化合物1-5在A2780和RPE-1细胞中，在黑暗中，在> 10 μM下没有细胞毒作用。相比之下，在两种细胞系中，所有化合物在所有测试波长的光照射下均诱导高光毒性。配合物1、3和4在浓度低至1µM时导致细胞活力的强烈降低，而配合物2和5仅在10 µM时显示出它们的光毒作用。值得注意的是，在这个初步实验中没有观察到对癌细胞有显著的选择性。重要的是，可以证明配合物1-4能够具有高达740 nm的光毒效应。鉴于这些有希望的结果，配合物的光毒性进行了更详细的评估。由于配合物2与1结构相似，配合物5光毒性较差，配合物2和配合物5被排除在进一步的研究之外。在A2780和RPE-1细胞中，经过4小时的孵育和1小时740 nm照射或在黑暗中孵育4小时，确定杀死50%细胞所需的复合物1、3和4的浓度(IC50)。所有配合物在黑暗中毒性均小于PpIX (IC50 = 3±2 μM)，其中1和3表现出最低的细胞毒性(IC50分别为58±9μM和62±10μM)。除PpIX外，其余化合物的IC50在740 nm光照下均显著降低，证实了其作为PDT PSs的潜力。值得注意的是，1对A2780细胞表现出最高的光毒性指数(PI = 118)，定义为暗毒性和光毒性之比。在健康的RPE-1细胞上也得到了类似的结果，证实了对癌细胞没有选择性。
由于复合物1作为PF6盐，在740 nm处被发现是最有效的PS，并且考虑到未来在结肠肿瘤小鼠模型中的体内实验，对人和小鼠结肠腺癌(HT29和CT26)细胞进行了额外的光毒性评估。为此，使用Amberlite IRA-410将PF6-反离子与氯离子Cl-交换，以确保在生物体中具有更好的溶解度，主要用于以后的体内试验。结果显示，配合物1在两种细胞系中表现出相似且较高的光毒性(HT29和CT26的IC50分别为0.33±0.03 μM和0.34±0.06 μM)。值得注意的是，结构相似的钌配合物[Ru(DIP)2dmbpy]2+在相同的低光剂量(14.2 J.cm-2) 在540 nm照射时，对CT26细胞具有相同的光毒性(IC50= 0.34±0.005 μM)。与此相反，先前在大鼠胶质瘤细胞F98中测试了锇配合物[Os(DIP)2(dpp)]2+的光毒性，其中dpp = 2,3-双(2-吡啶基)吡嗪，在625 nm照射后显示出明显低于配合物1的抗癌活性(IC50 = 86.1±8.5 μM)。先前描述的双核锇配合物[(Os(DIP))2pppp]4+，在808 nm照射下，使用较高的配合物浓度(≥10 μM)，对人黑色素瘤细胞具有较高的光热活性。此外，在低氧条件下，用近红外光照射微摩尔范围的Cl-反离子配合物1 (IC50, 740 nm = 4.75 ± 0.30 μM, IC50, dark = 46.44 ± 1.0 μM, PI = 10)后，发现其具有细胞毒性。重要的是，可以证明，即使在缺氧条件下，配合物1也表现出高达740 nm的光毒效应，这是对PDT剂的重要要求。
复合物1在740 nm(近红外波长)对A2780、CT-26和HT29三种测试细胞系的这些令人印象深刻的结果，促使作者在进行体内研究之前将其进行额外的实验。
光稳定性要评估的一个重要参数是PS的稳定性。因此，对1-5的稳定性进行了评估。这种稳定性首先是在黑暗中通过观察复合物在不同介质中孵育48小时后UV-Vis光谱的变化来确定的。本实验表明，所有配合物在CH3CN、PBS和DMSO中都是稳定的。值得注意的是，复合物被发现在PBS中难以溶解，需要补充1% DMSO。由于PDT需要光照，因此候选光敏剂的光细胞毒性活性受到其辐照后的光稳定性的强烈影响。为此，他们对配合物1-5在37°C下的生物相关介质中进行光稳定性研究(即PBS和DMEM介质(Gibco)，添加10% FBS)，在740 nm照射1小时。重要的是，在照射1小时后，PBS和DMEM中没有观察到配合物1-5的吸收光谱发生明显变化。细胞摄取和定位研究 在CT-26细胞中研究了锇配合物1-5的细胞摄取，方法是在10 μM下孵育4小时后，使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定细胞内的Os数量。发现Os配合物[Os(DIP)3] (PF6)2(5)的摄取最高，几乎是其他配合物的三倍。这可能是由于与bpy和phen相比，DIP配体具有更高的亲脂性。与配合物3和4相比，1和2的摄取也高2倍。配合物3和4的吸收较低可能是由于这些配合物的溶解度较低。NH2掺入bpy(配合物3)减少了配合物的内化。不幸的是，他们无法建立摄取量和光毒值之间的关系，因为该文所述的所有配合物都具有相似的光毒活性。为了进一步了解配合物1的内化机制，利用Os(II)配合物(λex = 448 nm，λem = 645-730 nm)的本征发光，用共聚焦显微镜对其进行了亚细胞定位。在CT26细胞中，5µM配合物1孵育4小时，发光表现为弥散和点状信号，表明该复合物在细胞质和一些囊泡室中积累。然而，复合物并未在细胞核和线粒体中积累，分别与Hoechst33342和MitoTracker Green未共定位。
三维多细胞肿瘤球体(MCTS)的光毒性
复合物1被认为是在2D细胞模型中研究的一系列锇配合物中最有希望的候选者。由于其非常高的光细胞毒性，作者在多细胞肿瘤球体(MCTS)模型中探索了其活性。在三维球体中，MCTS模拟了临床治疗肿瘤的条件，包括缺氧环境和细胞外基质沉积。此外，生长模式、代谢和基因表达模拟实体瘤初始阶段的复杂性。这些特征允许合理估计体内抗肿瘤活性，使MCTS成为比单层细胞培养更可靠的高级癌症研究模型。因此，他们进行了一项实验来评估配合物1对MCTS生长的时间依赖性影响。CT26 MCTSs (直径约550 μm)经1(0、1、10、30和100 μm)浓度递增处理。在孵育36小时后，在球体中观察到发光信号。然后将培养基与新鲜培养基交换，将细胞置于黑暗中或740 nm处照射1 h。在此处理之后，每两天交换井中一半的介质，并拍摄椭球体照片。重要的是，以30 μM和100 μM的配合物1处理的CT26 MCTS直径减小。相比之下，与未处理的MCTS相比，在黑暗(100 μM)中处理复合物的MCTS没有观察到任何影响。此外，复合物1在CT-26 MCTS中通过发光细胞活力测定进行了测试。复合物1对CT-26 MCTS具有较高的细胞毒性，IC50≈31±6 μM。这一结果与[Ru(DIP)2dmbpy]2+对HeLa MCTS的IC50相当。综上所述，复合物1在单层细胞模型中表现出的突出活性在MCTS模型中得到了证实。这是非常有趣的，因为椭球体的中心被认为是缺氧的(即氧气浓度低)，可以预期作者的复合物不会是有效的。这些发现为进一步研究复合物1作为一种新型潜在光敏剂在光动力治疗中的应用提供了有力的动力。
动态光散射(DLS)
作者之前观察到，含有两个DIP配体的Ru(II)配合物可以在等渗水溶液中形成聚集体。虽然它们在PBS中形成大型聚集物，但他们最近证明，在等离子蛋白存在的情况下，它们可以形成更小的纳米颗粒。就像带正电的金纳米颗粒一样，他们假设盐的存在减少了Ru(II)配合物之间的排斥静电相互作用，导致它们聚集。这种聚集在培养基中被等离子蛋白提供的包覆效应阻止，导致亚微米纳米颗粒的形成。由于这种聚集行为可能会影响配合物在体内的生物分布，他们进行了动态光散射(DLS)分析，以研究配合物1与Cl-反离子在10% FBS中在PBS中的聚集行为。10% FBS在PBS中不含该复合物的DLS分析显示存在平均直径为8.87 nm的纳米物，可能对应于血清白蛋白。当配合物1与Cl-反离子存在时，可以观察到物体的平均直径从8.87微妙地变化到12.68。这种微小的变化可以解释为复合物与白蛋白的结合，就像之前用其他药物观察到的那样。在100% PBS中，Cl-反离子的配合物1倾向于形成比沉积物更大的颗粒，这可以用肉眼观察到，DLS得到的高多分散性指数也证实了这一点。因此，与他们之前描述的Ru(II)配合物相比，在等离子蛋白存在的情况下观察到高达350 nm的纳米颗粒，配合物1似乎可溶于这种介质，这可能是由于它与等离子蛋白结合。
体内研究
复合物1在体外2D和3D模型中获得了令人鼓舞的结果，在CT26荷瘤BALB/c小鼠模型中进一步研究了其PDT疗效。瘤内注射1小时后，将小鼠置于黑暗中或用740 nm激光(50 mW, 12.6 J. cm-2,300 s)进行单光子照射，每2天测量并记录小鼠的肿瘤体积和体重，持续2周。根据肿瘤生长抑制曲线，发现用复合物1和light治疗的肿瘤在一次手术中几乎被根除。在第14天，复合物1 + Light组的归一化肿瘤体积分别比对照组、光处理组和复合物1不照射组小4.67、4.56和4.36倍。重要的是，复合物1处理的动物表现正常，没有疼痛、应激或不适的迹象，也没有体重减轻，这表明该化合物具有较高的生物相容性。治疗后用苏木精-伊红染色法对各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、肠)及肿瘤组织进行组织学检查。虽然未观察到所有器官的病理改变或损伤，但在肿瘤组织中观察到明显的损伤，包括核固缩和广泛的凋亡核区。采用末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)染色分析肿瘤组织。观察到Complex 1 + Light治疗的绿色荧光信号，表明细胞凋亡过程中DNA链断裂，表明其治疗效果较强。正如引言中所讨论的，Os基配合物TLD 1829在808 nm (600 j .cm-2,4 h)照射后，在结肠癌小鼠群体中也显示出较高的生存率与TLD1829 (808 nm, 600 j .cm-2,4 h)相比，配合物1 (740 nm, 12.6 j .cm-2,1 h)具有较低的光照暴露优势，TLD1829和配合物1在生物窗口光动力治疗方面具有重要潜力。
结论
综上所述，作者制备了结构简单的Os(II)多吡啶配合物，并对其进行了表征。这些配合物表现出优异的光物理性能，包括较高的1O2产量子率。重要的是，它们显示出全色吸收，使PS的照射波长达到740 nm。这个波长比钌类似物[Ru(DIP)2dmbpy]2+可以激发的最大波长要高得多。对非癌性视网膜色素上皮细胞(RPE-1)和宫颈癌细胞A2780的所有复合物进行细胞实验，黑暗中无细胞毒性，光照后有强毒性。重要的是，配合物1结构简单，在740 nm处具有良好的PI值，暗毒性低，辐照后的IC50在纳摩尔范围内。它还被证明对人类和小鼠结肠癌细胞(HT29和CT26)具有非常稳定的光毒性。配合物1较高的1O2产量子产率和吸收特性使其在体内具有良好的PDT疗效。这种简单的Os(II)多吡啶配合物有可能成为一种很有前途的抗肿瘤治疗剂。总的来说，该文的结果证实了锇聚吡啶配合物可能是用于PDT的下一代高效光敏剂。
参考文献
Structurally Simple Osmium(II) Polypyridyl Complexes as Photosensitizers for Photodynamic Therapy in the Near Infrared. Asma Mani , Tao Feng , Albert Gandioso , Robin Vinck , Anna Notaro, Lisa Gourdon, Pierre Burckel, Bruno Saubaméa, Olivier Blacque, Kevin Cariou, Jamel-Eddine Belgaied, Hui Chao,* and Gilles Gasser*. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202218347.https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202218347
