内容摘要
缺氧是恶性肿瘤的标志，已被认为是光动力疗法(PDT)的主要障碍。通过耐缺氧光敏剂(PS)在复杂的生物场景中精确靶向癌细胞是克服不可避免的肿瘤复发和转移的基石。在此，作者描述了一种有机NIR-II PS (TPEQM-DMA)，它具有强大的I型光疗功效，可以克服PDT在对抗缺氧肿瘤方面的固有缺陷。TPEQM-DMA表现出显着的NIR-II发射（>1000 nm），具有聚集诱导发射特征，并且在白光照射下仅通过低O2依赖型I型光化学过程有效地产生聚集态的超氧阴离子和羟基自由基.合适的阳离子性质有助于TPEQM-DMA在癌性线粒体中积累。同时，TPEQM-DMA的PDT破坏了细胞氧化还原稳态，导致线粒体功能障碍，并提高了致死性过氧化脂质的水平，从而诱导细胞凋亡和铁死亡。这种协同细胞死亡方式使TPEQM-DMA能够抑制癌细胞、多细胞肿瘤球体和肿瘤的生长。为了改善TPEQMDMA的药理特性，通过聚合物包封制备TPEQM-DMA纳米颗粒。体内实验证明了TPEQM-DMA纳米粒子对肿瘤的吸引人的NIR-II荧光成像引导PDT效应。
结果与讨论
设计、合成、光物理特性和单晶
缺氧肿瘤的精确光疗要求PS具有延伸至NIR区域的长发射波长、特异性和显着的癌细胞靶向效力以及高效的I型ROS生成能力。为了满足这些标准，采用了基于N,N-二甲基取代的TPE骨架的推拉式阳离子PS。扭曲的TPE结构赋予PS典型的AIE特性。通过合理调整受体的吸电子能力，可以实现位于单线态基态（S0）和激发三线态（T1）之间具有较小能隙（ΔES0-T1）的NIR-II区域的更长发射波长.上述降低的ΔES0-T1阻止了能量从PSs转移到周围的O2，并导致PSs具有I型光敏作用。此外，PSs固有的阳离子性质通过静电相互作用诱导恶性癌细胞优先归巢。方案中描述了所需AIE PS的详细合成。简而言之，前体TPEBr-DMA是在4-溴二苯甲酮和米歇勒酮存在下通过McMurry反应制备的。钯催化的Heck偶联反应在TPEBr-DMA和缺电子物质4-乙烯基吡啶（或 4-乙烯基喹啉）之间顺利进行，形成中性化合物TPEPDMA（或TPEQ-DMA）作为对照。带正电荷的部分最终通过碘甲烷的亲核取代和六氟磷酸钾的连续抗衡阴离子交换而安装，分别得到TPEPM-DMA和TPEQM-DMA的阳离子产物。所提出的结构很容易通过表征数据进行归属，包括 1H NMR、13C NMR 和高分辨率质谱。
首先在二甲基亚砜(DMSO)中测量开发的PS的吸收光谱。TPEQM-DMA的最长吸收带位于532 nm，可归类为从功能化TPE部分到喹啉部分的分子内电荷转移(ICT)跃迁。40观察到类似的ICT跃迁TPEP-DMA (406 nm)、TPEQ-DMA (418 nm)和TPEPM-DMA (476 nm)。显然，TPEQM-DMA的吸收带表现出最强的红移特性，表明TPEQM-DMA与基态的其他三种PS相比具有最好的电子耦合相互作用。接下来在具有不同水体积分数(fw)的DMSO/水混合物中评估PS的AIE效果。以TPEQM-DMA为例，在纯DMSO中检测到微弱荧光（绝对荧光量子产率为0.62%，荧光寿命为1.79 ns）。然而，随着水的比例增加，发射强度逐渐增强，并在fw为99% 时观察到强发射（绝对荧光量子产率为1.81%，荧光寿命为3.67 ns）。类似地，其他三个PS获得了增强的发射行为。上述发射增强可归因于高fw聚集体的形成，这有助于PS抑制非辐射衰变。41动态光散射和TEM成像进一步证实了99% fw纳米聚集体的存在。值得注意的是，TPEQM-DMA、TPEP-DMA和TPEQ-DMA的发射强度在较高fw时略有下降，这可能是由于纳米聚集体的形态和尺寸变化所致。此外，在吸收光谱的fw为99% 处观察到平坦的尾部，这归因于纳米聚集体形成引起的Mie散射。显然，所有PS都具有AIE效应。值得注意的是，与其他三种PS相比，TPEQM-DMA聚集体具有最长的发射波长（λmax = 960 nm），其一半发射位于NIR-II区域（>1000 nm）。当TPEQM-DMA在水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含10%胎牛血清 (FBS)的水和含10% FBS的PBS等不同介质中静置72小时后，发射光谱的变化可忽略不计，略有变化观察到粒径增加，表明其具有良好的稳定性。这些特性有利于TPEQM-DMA作为潜在生物成像应用的NIR-II试剂。
为了更好地了解AIE 效应，通过缓慢蒸发其丙酮溶液培养TPEQM-DMA单晶，并仔细检查其晶体学数据。TPEQMDMA采用非平面构象，由于TPE基团的存在，而中心乙烯基与相邻苯环之间的扭转角范围为46.21°至57.88°。同时，观察到头尾反平行堆积模式，相邻分子之间的距离测量为3.414 Å。在晶格中也发现了分子间C− H···F相互作用（2.489和2.429 Å）。上述因素有助于激发的TPEQM-DMA阻止非辐射衰变，并最终在聚集状态下增强发射。
聚合状态下的ROS生成和理论计算。随后使用商业2',7'二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCF-DA)作为广谱 ROS 指示剂评估聚集状态下AIE PS的光诱导ROS生成能力（DMSO/PBS，1/99，v/v）。由于AIE PS在可见光区域表现出强烈的吸收，因此采用白色LED光（400-700 nm）作为PDT的光源。用白光(25 mW cm−2 )照射DCF-DA和TPEQM-DMA聚集体的混合物后，DCF（DCF-DA的氧化产物）在530 nm处的荧光强度增加并在10秒内达到稳定水平，给出照射120秒后发射增强390倍。然而，当使用TPEPM-DMA、TPEQ-DMA、TPEP-DMA、玫瑰红（RB，II型参考）和结晶紫（CV，I型参考）时，DCF 的荧光增量速率下降，分别增强了350、280、110、260和320倍，表明TPEQM-DMA的ROS生成效率在聚合状态下高于商业RB和CV。在含有10% FBS的水中，TPEQMDMA增强了排放并降低了ROS生成效率，这可归因于FBS对TPEQMDMA的硬化能力。为了阐明ROS的具体类型，引入了各种荧光探针，包括单线态氧传感器绿（SOSG，用于1O2）、二氢罗丹明 123（DHR123，用于O2•−）和羟苯基荧光素（HPF，用于·OH）。当用白光(25 mW cm−2)照射SOSG和TPEQM-DMA聚集体的混合物时，SOSG在533 nm的发射几乎没有增加。对于其他三个PS，观察到类似的荧光沉默现象。然而，SOSG的排放曲线在RB存在下增加。用另一种1O2 捕集剂9,10 蒽二基双（亚甲基）二丙二酸(ABDA)代替SOSG时，AIE PS在相同条件下未检测到ABDA的吸收变化，证明没有产生1O2。相反，在白光(25 mW cm−2)存在TPEQM-DMA的情况下，DHR123在530 nm和HPF在520 nm的荧光强度急剧上升，导致900倍（对于DHR123）和187倍（对于HPF)照射300秒后增强。当切换到其他三个PS和CV时，DHR123和HPF的荧光增强程度明显下降。作为识别短寿命ROS的最可靠技术，电子顺磁共振(EPR)光谱学也被用于捕获AIE PS诱导的ROS。在用白光（100 mW cm-2，5分钟）照射5,5-二甲基-1-吡咯啉-Noxide（DMPO，自旋陷阱剂）和 TPEQM-DMA 聚集体的混合物后，尖锐的四线EPR信号在检测到g值为2.0053的1:2:2:1强度和14.8 G的超精细耦合常数，这与DMPO/·OH加合物的特征共振相匹配。对于其他三种PS和CV，观察到相对减少的DMPO/·OH 加合物信号。这一发现表明TPEQM-DMA具有更好的光敏·OH生成能力。不出所料，在没有白光或PS的情况下，EPR信号完全消失了。此外，白光照射后甲醇中的TPEQM-DMA检测到g值为2.0055的多线EPR信号，这归因于DMPO/O2 •-加合物的特征共振。照射4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP，1O2捕集剂）和AIE PSs的混合物后没有获得EPR信号，表明AIE PSs不能产生1O2。综上所述，AIE PSs显然更倾向于通过电子转移途径产生O2 •− 和·OH自由基，而TPEQMDMA无疑是最佳的I型PS候选者。采用铁细胞色素c还原法定量测量O2•− 量子产率。TPEQM-DMA获得的O2•−产量为0.0013，在pH值下高于金丝桃素7 (4.7*10-4)和一系列卟啉PSs (<10-4 ,使用EPR)。
为了破译I型ROS生成能力的起源，对TPEPM-DMA和TPEQM-DMA进行了理论计算。使用B3LYP/6-31G(d,p)方法对其基态几何结构进行优化，而激发能量的优化则通过Tamm−Dancoff近似(TDA)-B3LYP/6-31(d ,p)基组。根据图中绘制的前沿分子轨道，HOMO主要分布在TPE部分，而LUMO主要位于喹啉或吡啶部分。HOMO和LUMO之间的良好分离促进了AIE PS内的ICT转型。同时，HOMO-LUMO能隙从2.94 eV (TPEPM-DMA)变窄到2.81 eV(TPEQM-DMA)，导致TPEQM-DMA红移吸收，这与实验数据一致。光激发后，两个AIEPS都迅速弛豫到S1，S1通过ISC进一步衰减到T1。系统稳定在T1，促进电子从T1转移到环境分子以形成相应的自由基。值得注意的是，理论计算还描述了能量从AIE PS的T1转移到附近的3 O2以产生1O2是被禁止的，因为从T1到S0的垂直发射能量（TPEPM-DMA为0.90 eV，TPEQM-DMA为0.84 eV)小于氧气致敏阈值(0.98 eV)。
癌性线粒体靶向成像。设想具有大Stokes位移的NIRII发射使TPEQM-DMA受到激发和散射光的干扰更小，旨在实现更好的生物成像性能。为了揭示TPEQMDMA在细胞内的准确定位，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行了共定位实验。TPEQM-DMA在DMEM培养基中形成纳米聚集体，在980 nm处发出强烈荧光。在用TPEQM-DMA (20μM)和商业线粒体染料MitoTracker Green (MTG, 100 nM)对人乳腺癌细胞(MCF-7)进行染色后，通过Pearson相关系数(PCC)获得来自合并通道的清晰黄色信号0.93，证明TPEQM-DMA主要针对线粒体。为了排除TPEQM-DMA在其他细胞部分分布的可能性，TPEQM-DMA与特定商业染料之间的共定位实验包括LysoTracker Green（溶酶体染料）、DiO（质膜染料）、Hoechst 33342（核染料）和BODIPY493 /503（脂滴染料）进行了。令作者高兴的是，观察到0.17 (LTG)、0.05 (DiO)、0.12 (Hoechst 33342)和0.07 (BODIPY493/503)的小PCC。同时，TPEQM-DMA具有良好的光稳定性，连续激光扫描300 s后荧光信号保持在90%以上。发现TPEQ-MDA的中性前体在脂滴而不是线粒体中积累，表明TPEQM-DMA的线粒体靶向能力源于其适当的脂化特征。
作为一种生化指纹，恶性肿瘤更喜欢通过糖酵解而不是氧化磷酸化（Warburg效应）产生能量。这种不依赖氧的能量代谢表型促进了乳酸的分泌，从而提高了癌细胞表面的乳酸阴离子水平。同时，癌细胞呼吸增强通常导致比正常细胞(>60 mV)更高的超极化线粒体膜电位(ΔΨm)。恶性肿瘤的特征有利于离域亲脂性阳离子的内吞作用选择性地驻留在癌细胞的线粒体中。受益于TPEQM-DMA的阳离子性质，作者推测它可能通过上述模式将癌细胞与正常细胞区分开来。因此，不同的细胞系包括人肺腺癌细胞（A549）、人宫颈癌细胞（HeLa）、人肝癌细胞（HepG2）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）、小鼠结肠癌细胞（CT26）、小鼠胚胎成纤维细胞选择细胞(3T3-L1)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来验证这一假设。令作者高兴的是，在用TPEQM-DMA (20μM)对细胞进行染色后，癌症细胞系和正常细胞系在成像性能上存在明显差异。所有癌细胞系均成功染色，并发出来自线粒体的强烈荧光信号。形成鲜明对比的是，正常细胞系的线粒体荧光信号较差。从癌细胞中提取的荧光强度约为。比正常细胞高3倍。此外，癌细胞中TPEQM-DMA和MTG之间的PCC (>0.85)高于正常细胞(<0.39)。为了证明TPEQM-DMA在更具挑战性的生物环境中的潜在应用，进行了使用混合癌细胞和正常细胞的染色实验。选择人胶质母细胞瘤细胞(U-87 MG-fluc-GFP)作为指示细胞，因为它们可以稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)并有助于将它们与其他细胞区分开来。在将U-87 MG-fluc-GFP细胞与MCF-7细胞进行传代培养并用TPEQM-DMA (20μM)处理后，所有细胞都出现了强烈的红色荧光信号。进一步的线性分析表明U-87 MG-fluc-GFP和MCF-7细胞同时被TPEQMDMA染色。当MCF-7细胞被CHO细胞取代时，U-87 MG-fluc-GFP细胞仍可被TPEQM-DMA染色以产生强烈的红色荧光，而CHO细胞仅呈现可忽略不计的荧光。不出所料，当在混合的MCF-7和CHO细胞中应用TPEQM-DMA时，获得了类似的癌症特异性染色结果，并且来自MCF-7细胞的荧光强度比来自CHO细胞的荧光强度高4倍。以上结果令人信服地表明，TPEQM-DMA可以通过准确定位在癌性线粒体中成为一种有前途的肿瘤特异性荧光追踪剂。
细胞内I型ROS生成和体外PDT效应。受有效的I型ROS生成和特定癌性线粒体靶向的启发，作者推测TPEQMDMA可以在缺氧环境下有效地消融癌细胞。为了证明这个想法，首先评估了TPEQM-DMA的光诱导细胞内ROS的类型。在常氧气氛下用白光(25 mW cm-2)照射DCF-DA和TPEQM-DMA预染的MCF-7细胞后，DCF的荧光逐渐出现。荧光信号的增长在短照射时间（180秒）内达到饱和，与对照组相比增强了7.1倍。通过流式细胞仪定量分析光敏TPEQM-DMA产生的ROS。用TPEQM-DMA和白光（25 mW cm−2，180 s）处理的组表现出最高的ROS阳性细胞群百分比（>99%），这CLSM图像一致。接下来引入各种ROS清除剂，包括叠氮化钠（用于1O2）、D-甘露醇（用于·OH）、钛铁（用于O2 •−）、丙酮酸钠（用于H2O2）和维生素C（用于自由基）以确定种ROS.58在D-甘露醇、钛铁或维生素C存在下，细胞中DCF 的荧光被显着阻断，表明·OH和O2 •−的产生。相比之下，叠氮化钠或丙酮酸钠预处理组观察到未受影响的荧光信号，排除了1 O2和H2O2的产生。常氧条件下强烈的I型ROS生成能力促使作者探索TPEQM-DMA在缺氧条件下的光敏作用。构建缺氧环境，并通过缺氧/氧化应激检测试剂盒（ROS-ID）确定细胞缺氧状态，该试剂盒在缺氧环境下会发出明亮的红色荧光。与对照组相比，缺氧条件导致 ROS-ID的荧光增强4.8倍，证明体外缺氧条件的成功设置。之后，在缺氧条件下使用不同的染色检测方法，包括二氢乙锭（DHE、O2•-指示剂）、HPF和SOSG。在用DHE预染的MCF-7细胞处理后检测到明显的红色荧光TPEQM-DMA (20μM)和白光照射（25 mW cm−2，3分钟），与对照组相比增强了7.2倍。重要的是，上述荧光增强与常氧条件下的相应组非常相似（8.1倍）。无论是在缺氧（5.77倍）还是含氧量正常（7.02倍）条件下，用HPF处理的细胞也观察到增强的荧光强度。与此形成鲜明对比的是，在相同条件下检测到的SOSG荧光可忽略不计。上述发现表明TPEQM-DMA在低氧活细胞白光下主要产生O2•−和·OH，有利于加强肿瘤微环境下的PDT效应。
作为细胞的发电站，线粒体也会产生O2 •−，O2 •−可以通过超氧化物歧化酶(SOD)介导的歧化作用和随后的Fenton（或Haber-Weiss）反应进一步转化为·OH。61为了证明上述细胞内O2 •−和·OH主要来源于光敏TPEQM-DMA而不是内源性生化转化，2-甲氧基雌二醇（2-ME，一种有效的SOD抑制剂）被用来抑制SOD的歧化作用。可忽略不计的荧光无论是否引入2-ME和白光，在未经TPEQM-DMA处理的MCF-7细胞中均观察到DHE，排除了内源性O2•−的影响。然而，即使在存在2-ME的情况下，在照射TPEQM-DMA预处理的MCF-7细胞后，DHE的荧光也得到增强，与对照组相比增强了5.36倍和6.22倍。在相同的照射条件下，HPF获得了类似的TPEQM-DMA依赖性荧光增强。更重要的是，与未使用2-ME的组相比，同时使用TPEQM-DMA和2-ME的组HPF的排放增量有所降低，这意味着抑制SOD活性抑制了从O2 •−到•OH的转化。显然，累积的O2 •−和·OH主要来自TPEQM-DMA的光敏作用。同时，借助内源性SOD，O2 •−可转化为毒性更强的·OH，有利于进一步加强光疗。
凭借I型ROS生成能力，使用MTT测定定量评估了TPEQM-DMA的体外抗癌效力。在含氧量正常（IC50值为188.4μM）和缺氧（IC50值为212.7μM）条件下，TPEQM-DMA对MCF7细胞的暗毒性可忽略不计，证明其具有出色的生物相容性。当引入白光（25 mW cm-2，30分钟）时，细胞增殖以剂量依赖的方式受到抑制，IC50值降低至10.98μM（PI值17.16，常氧条件）和13.81μM（PI值分别为15.4，缺氧条件）。TPEQM-DMA虽然光毒性不高，但由于其低氧依赖性ROS生成能力，缺氧IC50值接近常氧，有利于缺氧肿瘤的治疗。相反，与常氧相比，商业PS（二氢卟酚e6，Ce6）63在低氧条件下的光毒性降低，而IC50值从4.77μM增加到69.37μM，PI值从99.25下降到7.07。值得注意的是，精确肿瘤治疗的一个关键要求是选择性破坏癌细胞而不是正常细胞。令作者高兴的是，TPEQMDMA在常氧条件下对CHO细胞表现出极低的光毒性，IC50值为125.5μM，PI值为1.83。使用钙黄绿素乙酰氧基甲基酯（钙黄绿素AM）和碘化丙啶(PI)的进一步活细胞和死细胞染色实验证实了TPEQM-DMA极好的耐低氧PDT性能。在用TPEQM-DMA预处理的MCF-7细胞照射后，钙黄绿素AM的绿色荧光逐渐减弱，而PI的红色荧光随着TPEQM-DMA浓度的增加逐渐出现，无论是在含氧量正常还是低氧条件下。上述发现直观地验证了光敏TPEQM-DMA可以在低氧条件下有效地消融癌细胞。
PDT诱导的细胞凋亡和铁死亡。为了更好地理解这种线粒体靶向I型PDT在缺氧条件下对癌细胞的作用机制，对细胞死亡模式进行了详细评估。不同的细胞死亡抑制剂，包括 L-丙氨酰胺（z-VAD-fmk，细胞凋亡抑制剂）、ferrostatin-1（Fer-1，铁死亡抑制剂）、3 甲基腺嘌呤（3-MA，自噬抑制剂）、necrostatin-1（Nec-1，细胞坏死抑制剂）和belnacasan（VX-765，细胞焦亡抑制剂）。在照射TPEQM-DMA预处理的MCF-7细胞后，用3-MA、Nec-1或VX-765处理的组获得了显着的细胞增殖阻断，这与没有处理的对照组相似细胞死亡抑制剂。然而，在引入zVAD-fmk或Fer-1时，与对照组相比，细胞增殖增强，细胞活力分别上升至 77% (z-VAD-fmk)和52% (Fer-1)。以上结果推断细胞凋亡和铁死亡是主要的细胞死亡途径。
之后，在低氧条件下研究了与线粒体靶向细胞凋亡和铁死亡相关的关键生物学事件。亚铁离子(Fe2+)催化的芬顿反应导致氧化磷脂(oxPLs)的异常积累被认为是铁死亡的标志。因此，分别使用MDA和GSH/GSSG 测定法评估脂质氧化和细胞内氧化还原状态。在用白光（25 mW cm-2，30分钟）照射 TPEQM-DMA预染的MCF-7细胞并随后静置3小时后，MDA的含量增加了1.8倍对照组不做任何处理。同时，GSH水平较初始值下降30%。oxPLs的积累和细胞内氧化还原状态的不平衡暗示了铁死亡的存在。除了铁死亡外，还确定了TPEQM-DMA介导的细胞凋亡。作为细胞自我毁灭的一种方式，细胞凋亡受到线粒体的高度调节。线粒体中外源性 ROS 的大量积累导致破坏性氧化应激，从而导致线粒体功能障碍并启动细胞凋亡途径。在含氧量正常或缺氧的气氛下用TPEQM-DMA处理MCF-7细胞后，明亮的观察到JC-1的红色荧光（ΔΨm指示剂），表明相对较高的ΔΨm。然而，当在相同条件下照射TPEQM-DMA预染的MCF-7细胞时，可以看到绿色荧光，表明ΔΨm下降。ΔΨm的丢失表明光敏TPEQM-DMA可能会扰乱线粒体功能，从而促进随后的细胞凋亡。使用膜联蛋白 V-FITC/PI染色测定法进一步监测细胞凋亡过程。对于单独使用TPEQM-DMA处理的MCF-7细胞，无论是绿色通道（膜联蛋白V-FITC，早期凋亡指示剂）还是红色通道（PI，晚期凋亡指示剂）均未检测到荧光。在白光照射下（25 mW cm−2，30分钟），出现绿色荧光。将受照射的细胞再孵育3小时，可以清楚地观察到红色荧光，表明发生了细胞凋亡。另外，通过流式细胞术定量细胞凋亡。当TPEQM-DMA染色的MCF-7细胞用白光照射（25 mW cm-2，30分钟）并再孵育3小时时，观察到最高的凋亡细胞群百分比(89.76%)。
基于上述结果，给出了这种双模式程序性细胞死亡的推测机制图。在白光照射后，TPEQM-DMA在线粒体中产生的O2 •− 通过歧化和芬顿反应轻松转化为毒性更强的·OH。累积的·OH打破了oxPLs的产生和清除之间的平衡，并激活了铁死亡途径。同时，线粒体中外源性O2•− 和·OH的大量产生通过激活细胞p53蛋白上调促凋亡蛋白（Bax）的表达并下调抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达，从而导致激活称为caspase-3的死亡蛋白酶以诱导细胞凋亡。为了证明上述假设，通过Western blot对细胞凋亡和铁死亡相关的信号蛋白进行了分析。用白光照射TPEQM-DMA染色的MCF-7细胞30分钟并在低氧条件下静置3小时后，caspase-3的表达下降，而裂解的caspase的量-3增加。考虑到caspase-3的无活性酶原应被蛋白水解加工成裂解的caspase-3（p17和p12片段）以执行细胞凋亡，裂解的caspase-3的富集无疑证明了细胞凋亡的发生。除caspase-3外，谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)的表达水平也明显受到抑制。值得注意的是，这种GPX4表达趋势与GSH/GSSG检测非常吻合。作为不可或缺的oxPLs清道夫，GPX4 通过募集GSH/GSSG的抗氧化系统来减少促铁死亡信号。GPX4的耗尽明显加速了oxPLs的积累，从而导致铁死亡细胞死亡。
PDT对3D多细胞肿瘤球体和体内的疗效。3D多细胞肿瘤球体(MCTS)通常适用于模拟缺氧实体瘤的微环境。培养直径约600μm的MCF-7细胞的MCTS以评估 TPEQM-DMA的PDT效果。将MCTSs与TPEQM-DMA(50μM)孵育30分钟，整个球体出现强烈的荧光强度，表明MCTSs已成功被TPEQM-DMA浸润。在白光照射下（25 mW cm−2，30分钟），MCTS在3天后逐渐崩溃并几乎崩溃，表明TPEQM-DMA对缺氧实体瘤具有潜在的PDT作用。相比之下，观察到单独使用TPEQM-DMA或用白光处理的MCTS的形态变化可忽略不计，表明TPEQM-DMA和白光具有良好的生物安全性。
为了直观地展示TPEQM-DMA介导的I型光疗过程在抗肿瘤方面的优点，作者从肿瘤成像和光触发肿瘤消融方面评估了小鼠实验中的抗肿瘤效力。首先，检查了TPEQM-DMA对CT26细胞的PDT效应，结果表明TPEQM-DMA介导的PDT对细胞内ROS的产生、ROS的种类和细胞死亡与MCF-7细胞相似。在低氧条件下，TPEQM-DMA对CT26细胞的IC50值从166μM（暗下降到12.61μM（光），PI值为13.16，表明TPEQM-DMA对CT26具有高光毒性。然后，通过皮下接种CT26细胞建立荷瘤BALB/c小鼠模型。当在盐溶液中形成聚集体时，观察到TPEQM-DMA的强荧光。NIR-I荧光图像显示，由于被动靶向转运效率差，TPEQM-DMA在静脉注射后无法在肿瘤部位积聚。因此，作者采用瘤内给药进行体内实验。在TPEQM-DMA注射后1小时后，仅从肿瘤部位获得了不同的NIR-I和NIR-II荧光信号。重要的是，这些来自肿瘤部位的明亮NIR荧光信号在给药后保留超过24小时，而不受邻近组织的干扰。相反，当用盐水替换TPEQM-DMA时，在预定时间没有从肿瘤区域观察到NIR发射信号。固有的NIR-II荧光以及优先和长期的肿瘤内保留能力使TPEQM-DMA能够减轻组织自发荧光的潜在干扰，这有利于肿瘤成像和治疗。
随后，全面验证了TPEQM-DMA的体内抗肿瘤效力。无论是否引入白光照射（100 mW cm-2，10分钟），在盐水处理组中均观察到肿瘤的侵袭性生长。在黑暗中用TPEQM-DMA处理的组获得了类似的旺盛肿瘤生长，证明了TPEQMDMA的生物相容性。然而，一旦将TPEQM-DMA给药的肿瘤暴露在白光下，肿瘤的生长就会受到抑制，并伴有肿瘤消退和结痂。在治疗结束时，与空白组相比，同时接受TPEQM-DMA和光照治疗的小鼠肿瘤体积缩小至13%。此外，在整个治疗过程中未观察到明显的体重异常，表明TPEQM-DMA对体内系统具有良好的适用性。为了进一步评估体内肿瘤抑制功效，对苏木精和伊红(H&E)染色的肿瘤切片进行组织病理学分析。对于同时使用TPEQM-DMA和光处理的肿瘤，可以看到明显的没有细胞核的凋亡和坏死肿瘤细胞，而在其他组中没有造成明显的肿瘤损伤迹象。同时，在主要器官中观察到可忽略不计的破坏性细胞凋亡/坏死或炎症反应，支持TPEQM-DMA的生物安全性。PDT治疗后小鼠的离体荧光图像也显示，除了肿瘤部位有明显信号外，其他重要器官几乎没有近红外荧光信号存在。卓越的抗肿瘤效力和最小的副作用直观地证明了TPEQM-DMA介导的癌性线粒体特异性I型光疗过程提供了一种有效而准确的征服肿瘤的策略。
为了提高实用性，使用635 nm激光评估TPEQM-DMA的ROS生成。在635 nm激光照射(250 mW cm−2)下，TPEQM-DMA可以在聚集状态和活细胞中有效地产生O2•−和• OH自由基。与单独的TPEQM-DMA相比，TPEQM-DMA在含氧量正常和低氧条件下的光毒性增强。为了改善药理特性，通过封装DSPE-mPEG2000制备TPEQM-DMA纳米粒子(TPEQM-DMA NPs)，其在232 nm左右表现出均匀的直径。与TPEQM-DMA聚集体相比，TPEQM-DMA NP在635 nm 激光照射下表现出相似的吸收/发射光谱和I型ROS生成能力。对CT26细胞染色60分钟后，TPEQM-DMA NPs可以内化到细胞中并主要聚集在线粒体中，PCC值为0.91。TPEQM-DMA NPs对CT26细胞保持高度光毒性。CT26荷瘤小鼠静脉注射TPEQM-DMA NPs后，在肿瘤部位观察到清晰的NIR II荧光信号，信号可维持48 h以上，表明TPEQMDMA NPs具有有效的肿瘤靶向性和长期滞留性。小鼠的体外荧光成像也证实了这一结果。当静脉内注射TPEQM-DMA NP的小鼠暴露于635 nm激光（250 mW cm-2，10分钟，每5天）时，肿瘤的生长在10天后得到有效抑制。上述结果证明了TPEQM-DMA NP的潜在实际应用。
结论
总之，作者开发了一种具有NIR-II发射的线粒体特异性PS (TPEQM-DMA)，并通过I型PDT过程将其用于缺氧肿瘤治疗。TPEQM-DMA具有典型的AIE特性，发射扩展到NIR-II(>1000 nm)区域。高效的ISC和低T1能级使TPEQM-DMA聚集体即使在严重缺氧条件下（<0.1% O2），也能仅通过I型光化学在白光照射下有效地产生O2 •−和·OH。受益于适当的脂肪定位特征，TPEQM-DMA优选驻留在癌细胞的线粒体中，而不是正常细胞。重要的是，光敏化TPEQM-DMA产生的大量ROS提高了PDT的低氧耐受性，进而引起线粒体功能障碍并扰乱细胞脂质修复系统，最终通过细胞凋亡和铁死亡导致细胞死亡。TPEQM-DMA介导的PDT可以有效分解MCTS，验证其克服肿瘤缺氧的潜在能力。独有的I型光疗优势，让TPEQM-DMA可灵活应用于肿瘤治疗，无明显副作用。通过封装DSPE-mPEG2000 进一步制备TPEQM-DMA NP。将TPEQM-DMA NPs静脉注射到小鼠体内后，可以高效地在肿瘤中蓄积，通过PDT效应抑制肿瘤的生长。这种具有I型PDT活性的线粒体靶向NIR-II PS为缺氧肿瘤光疗提供了有效的作用，即使白光的穿透深度有限。作者预计这项工作将激发对具有多模态生物医学应用的强效I型PS的合理设计。
参考文献
Efficient NIR-II Type-I AIE Photosensitizer for Mitochondria-Targeted Photodynamic Therapy through Synergistic Apoptosis–Ferroptosis.Jiabao Zhuang, Bing Wang, Huan Chen, Keyi Zhang, Nan Li, Na Zhao, and Ben Zhong Tang.ACS Nano Article ASAP. DOI: 10.1021/acsnano.2c12319
