内容提要
大多数光动力疗法(PDT)都是通过高度依赖于O2的II型光反应生成单线态氧(1O2)。实体肿瘤缺氧微环境严重影响治疗效果，本文提出了一种新的设计，将传统的酞菁基光敏剂的光物理和光化学性质从II型光反应转移到高效的I型光反应和振动松弛诱导光热转换，在常氧和低氧条件下都能显示良好的光疗效果。此外，NanoPcAF在静脉注射后在肿瘤组织中有高水平的积累，在临床前模型中，0.8 nmol.g−1 NanoPcAF和300 J.cm−2光剂量时，94%的肿瘤生长被抑制。
结果与讨论
硅(IV)酞菁由于其在光治疗窗口(650 ~ 850 nm)的强吸收、高活性氧(ROS)量子产率以及通过轴向化学修饰可调谐的光化学性质等优点，已被广泛探索作为PDT的第二代PSs。到目前为止，两种硅(IV)酞菁(Pc4和RM-1929)目前正在临床试验中。然而，大多数现有的硅(IV)酞菁主要通过II型机制产生单重态氧(1O2)，高度依赖于O2水平，导致这种PDT对缺氧肿瘤的治疗效果有限。最近，Peng的团队报道了尼罗蓝衍生物在光照射下通过I型机制产生O2•−。受Peng工作的启发，我们引入与尼罗蓝结构类似的吩噻嗪结构，以调节硅(IV)酞菁的光物理和光化学性质。该结构具有良好的生物相容性，带羟基的侧链有助于共价偶联。因此，我们设计两种具有一个或两个吩噻嗪的多功能硅(IV)酞菁衍生物。PcAF可以在水溶液中自组装形成均匀的纳米颗粒分布(NanoPcAF)， NanoPcAF的平均尺寸约为150 nm。透射电镜(TEM)结果显示NanoPcAF呈规则的球形，直径约为130 nm 。NanoPcAF在纯水和含10%胎牛血清(FBS)的水中放置1周以上，其平均尺寸、电子吸收光谱和荧光发射光谱均无明显差异。这些结果表明NanoPcAF具有良好的分散稳定性，这将有利于其在生物医学领域的应用。
为了更好地理解PcAF的自组装行为和组装机理，我们采用不含吩噻嗪的硅(IV)酞菁衍生物(PcA)和含两个吩噻嗪的硅(IV)酞菁(PcBF)研究它们的聚集现象。PcA在水溶液中自组装形成100 nm均匀的纳米颗粒分布(NanoPcA)。相对于NanoPcA的良好稳定性，PcA在时效超过1 h后出现了严重的聚集现象，尺寸约为1200 nm。1 d后PcA形成了团聚和沉淀。吩噻嗪基团在硅(IV)酞菁的自组装形成均匀稳定的纳米粒子中起着关键作用。PcBF在水溶液中自组装形成均匀的纳米颗粒分布(NanoPcBF)。此外，NanoPcBF在水中和含10%胎牛血清的水中表现出较好的稳定性。与NanoPcAF相比，NanoPcBF在水中表现出类似的吸收，但更强的荧光强度。这些结果再次表明，吩噻嗪基团的引入有利于硅(IV)酞菁的自组装，形成稳定的纳米颗粒。在酞菁硅(IV)上引入两个吩噻嗪基团可能使NanoPcBF的内部分子排列不够紧密，因为PcBF的自组装行为可能只是由于疏水性和π−π堆积。然而，除了PcAF分子之间的疏水相互作用和π−π堆积外，PcAF酚羟基之间的氢键相互作用也可能促进PcAF的自组装行为。因此，NanoPcBF比NanoPcAF具有更强的荧光发射，不利于光动力和光热效应的改善。
一般情况下，PS吸收的光子可以通过三种不同的方式释放，包括荧光、振动弛豫产生热量和进行系统间交叉(ISC)，生成有利于ROS生成的三重态。NanoPcAF在水中的荧光较弱，表明NanoPcAF在光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT)中具有巨大的潜力。为了确认NanoPcAF的光动力学特性，在后续实验中测量了NanoPcAF的O2•−和1O2生成效率。二氢乙啶(DHE)作为荧光探针检测O2•−。NanoPcAF在光照射下生成O2•−的能力是NanoPcA的3.2倍。与MB相比，NanoPcAF也表现出更好的生成O2•−的能力。在低氧条件下，测量了NanoPcAF生成O2•−的能力。在NanoPcAF组中，DHE探针在缺氧条件下的荧光强度与正常条件下相比没有显著降低。这说明纳米NanoPcAF在光照射下生成O2•−与O2水平无关。在缺氧条件下，NanoPcAF产生的O2•−比MB多3.4倍。我们还探索了NanoPcBF生成O2•−的能力。与NanoPcAF相比，NanoPcBF表现出较弱的O2•−生成，这可能是因为NanoPcBF吸收的光能以荧光的形式释放更多。与NanoPcBF相比，NanoPcAF具有更高的低氧肿瘤PDT潜力。随后，采用单氧传感器绿色(SOSG)作为荧光探针检测1O2。MB在光照射下产生了显著的1O2。而NanoPcAF组中SOSG的荧光强度在光照射后几乎没有增加，说明NanoPcAF产生1O2的能力可以忽略不计。这些结果表明NanoPcAF具有良好的I型光反应，吩噻嗪基团在其中起着关键作用。
以水和ICG作为对照，研究了NanoPcAF的光热性能。NanoPcAF在水中的温度迅速升高，在光照射10 min后升高约30℃，而对照组的温度变化不明显。通过改变NanoPcAF的浓度和685 nm激光的能量密度来测量其在水中的光热效应。功率密度越大，温度升高越高。当激光功率密度保持在0.5 W cm−2时，还观察到显著的浓度依赖性温度升高。当NanoPcAF浓度为10 μM时，NanoPcAF在水中的温度达到57℃。NanoPcAF的光热转换效率达到18.3%。此外，经过4次加热/冷却循环后，NanoPcAF没有观察到明显的光漂白。NanoPcAF的紫外-可见光谱在辐照10min后没有明显下降，而ICG在相同辐照时间内明显下降。这些结果表明NanoPcAF在PTT过程中保持了良好的光稳定性。NanoPcAF可以将传统硅(IV)酞菁的光物理和光化学性质从II型光反应转移到高效的I型光反应和振动松弛诱导光热转换。
首先评估了在常氧和缺氧条件下，NanoPcAF在人肝癌(HepG2)细胞内生成O2•−的能力。缺氧条件下厌氧指示器(ROS-ID)的荧光强度比正常条件下高6.9倍，说明后续体外实验成功构建了缺氧条件。随后，用DHE作为O2•−荧光指示剂检测NanoPcAF细胞内O2•−生成能力。在没有光照的情况下，NanoPcAF不能在细胞中产生O2•−。在685 nm光照射下，无论在常氧或低氧条件下，细胞都能观察到明显的DHE荧光。与常氧条件下相比，低氧条件下DHE荧光强度没有显示任何降低，表明NanoPcAF在常氧和低氧环境下均能诱导体外O2•−效率。此外，添加自由基清除剂维生素C (VC)后，细胞内O2•−降低了4.0倍，证实了NanoPcAF具有较强的生成O2•−的能力。我们还使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为探针，检测HepG2细胞中NanoPcAF细胞内ROS的生成。当细胞与NanoPcAF孵育而没有光照射时，不产生ROS。然而，在685 nm激光照射后，DCFHDA在常氧和缺氧条件下都显示出明亮的绿色荧光，说明无论在常氧或缺氧条件下，NanoPcAF都能有效地产生ROS。与常氧状态相比，低氧状态下细胞内ROS并没有降低，这与O2•−检测结果一致。采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5 -二苯基- 2h -四唑溴化铵(MTT)比色法评价NanoPcAF的体外光治疗效果。NanoPcAF在黑暗环境下未观察到明显的毒性。而在685 nm光照，NanoPcAF在常氧和低氧条件下均表现出显著的浓度依赖性细胞毒性，90%的抑制浓度(IC90)分别为0.45±0.08 μM和0.42±0.10 μM。这些结果表明，O2浓度对NanoPcAF的细胞毒性没有影响。为了进一步证实NanoPcAF的体外光疗机制，一方面用VC处理细胞清除自由基。与NanoPcAF +光组相比，NanoPcAF + VC +光组的治疗效果明显下降，这应该是PDT受到抑制的结果。另一方面，冰袋被用来控制细胞的温度。与NanoPcAF +光组相比，NanoPcAF +冰+光组的细胞抑制作用也降低。NanoPcAF +冰+光组的IC50达到3.69±0.12 μM，是NanoPcAF+光组的8.2倍。这些结果表明PTT在光细胞毒性中也起重要作用。活/死细胞染色实验结果也表明PTT和PDT在NanoPcAF诱导细胞死亡的光细胞毒性中发挥了重要作用。NanoPcAF由于其优越的I型PDT和PTT能力，在常氧和缺氧条件下均具有较高的体外光治疗效果。这些结果进一步表明，NanoPcAF在光动力治疗中表现出高的I型光反应和光热作用协同效率来克服缺氧条件。
以肝癌(H22)小鼠为实验对象，静脉注射NanoPcAF，观察NanoPcAF的生物分布。选择H22是因为它相对容易建立肿瘤模型。利用荧光成像技术评价NanoPcAF在体内的生物分布。荧光图像连续监测至24 h，发现肿瘤部位的荧光信号逐渐增加，在10 h时达到最大值。虽然NanoPcAF在水中的荧光非常弱，荧光成像结果显示，注射NanoPcAF 10 h后，荧光信号清晰，且几乎只出现在肿瘤部位，这可能是由于NanoPcAF具有显著的肿瘤聚集能力，并在肿瘤部位恢复了荧光生成。老鼠牺牲24小时接受和肿瘤的荧光强度和其它主要器官包括皮肤、心、肝、脾、肺、肾进行评估。肿瘤部位的荧光信号远高于其他器官。肿瘤的荧光强度是肝脏的5.1倍。这个肿瘤/肝脏的比值比大多数报道的PSs要高得多，表明NanoPcAF具有出色的肿瘤靶向能力。为了研究NanoPcAF在体内的稳定性，还利用体内荧光成像技术评价了NanoPcAF在含10%胎牛血清的水中的生物分布。荧光成像结果与在纯水中注射NanoPcAF的小鼠相似。此外，由于CEL是一种常见的表面活性剂，可以破坏PSs的自组装，因此在注射小鼠之前，我们使用cremoophor EL (CEL)破坏NanoPcAF的结构。在含1% CEL(v/v)的水中，PcAF在吸收光谱中呈现强烈吸收，在610 nm激发下发出强烈的荧光，说明NanoPcAF的纳米结构被CEL破坏。将含1% CEL的NanoPcAF注入荷瘤小鼠体内，荧光信号迅速扩散至全身，然后逐渐减弱，无明显肿瘤积聚。体外荧光分布也显示，荧光信号主要存在于肝脏。这些结果表明，NanoPcAF在生理环境中具有良好的稳定性，而未断裂的纳米结构在肿瘤选择性中发挥着关键作用。其次，利用光热成像监测NanoPcAF在体内的肿瘤积累。H22肿瘤小鼠静脉注射NanoPcAF。使用685 nm激光(0.5 W cm−2)每隔一小时照射肿瘤部位3分钟。在照射过程中，通过红外热像仪持续评估肿瘤部位的温度。热成像持续监测至24小时。注射NanoPcAF 10小时后，肿瘤部位温度明显升高，约升高28°C。光热成像观察到的肿瘤富集时间与上述荧光成像结果一致。
由于NanoPcAF具有良好的肿瘤聚集能力，我们进一步对H22荷瘤小鼠进行了体内光治疗。小鼠分为6组：(1)对待PBS(控制),(2)关照1(激光波长685 nm),(3)光照2(激光波长685 nm),(4) NanoPcAF,(5) NanoPcAF + light 1, 和(6)NanoPcAF + light 2，NanoPcAF联合光2照射小鼠后，温度升高约30°C。仅用光2处理的小鼠和先用NanoPcAF再用光1处理的小鼠的温度都有轻微变化。然后，每隔一天对各组小鼠的体重和肿瘤体积进行评估。各组小鼠体重无明显差异，并在治疗过程中保持稳定增长。小鼠肿瘤体积在不同组之间显示出显著的变化。所有对照组(包括PBS、light 1、light 2和NanoPcAF单独)均显示出显著水平的肿瘤生长，而NanoPcAF + light 1组和NanoPcAF + light 2组的肿瘤生长均受到明显抑制。14天之后,肿瘤治疗的老鼠1 NanoPcAF其次是光辐照表现出抑制增长64%,这应该来自PDT的影响是引起肿瘤部位的温度显示一个微不足道的增加后,老鼠接受NanoPcAF光1紧随其后。与NanoPcAF + light 1组相比，NanoPcAF + light 2组的肿瘤抑制效果显著提高(94%)，这应该得益于PDT和PTT的联合作用。因此，这些结果表明，NanoPcAF通过PTT与I型PDT联合具有高效的抗肿瘤能力。代表性图像和肿瘤平均重量进一步证实了NanoPcAF在光照射下具有显著的抗肿瘤效果。
总结
本文开发了一种新型的纳米结构NanoPcAF，基于硅(IV)酞菁与奋宁轴向单取代的自组装。NanoPcAF与传统PSs不同，后者通过II型机制作为PDT生成1O2。NanoPcAF通过I型机制产生了丰富的O2•−，并具有良好的光热性能，使其能够克服PDT中的肿瘤缺氧。荧光成像和光热成像结果表明NanoPcAF在静脉注射后有明显的肿瘤聚集。因此，NanoPcAF具有很好的I型光反应和光热作用协同抑制肿瘤生长的作用。结果表明，NanoPcAF在临床上是一种很有前景的低氧肿瘤治疗光敏剂。
参考文献
NanostructuredPhthalocyanine Assemblies with Efficient Synergistic Effect of Type IPhotoreaction and Photothermal Action to Overcome Tumor Hypoxia in PhotodynamicTherapy. Yuan-Yuan Zhao, Ling Zhang, Zixuan Chen, Bi-Yuan Zheng, Meirong Ke, XingshuLi,* Jian-Dong Huang*. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 13980−13989 .https://doi.org/10.1021/jacs.1c07479
