内容提要
铁死亡是一种新发现的调节细胞死亡形式，正在成为一种有前途的肿瘤治疗方法。然而，细胞内在芬顿化学的时空控制来调节肿瘤铁死亡仍然具有挑战性。该研究报道了一种基于恶嗪的可激活分子组装(PTO-Biotin Nps)，它能够通过近红外(NIR)光以优异的时空分辨率触发溶酶体功能障碍介导的芬顿途径，以引起铁死亡。在这个系统中，设计了一个pH响应的近红外光热恶嗪分子，并将其与肿瘤靶向的亲水性生物素-聚乙二醇(PEG)链功能化，以在单分子框架内设计出定义良好的纳米结构组件。PTO-Biotin Nps具有选择性倾向于溶酶体在肿瘤细胞内的积累，这是由于其在酸性微环境中增强的光热活性所调节的。在近红外光激活下，PTO-Biotin Nps促进溶酶体功能障碍，诱导细胞质酸化和自噬受损。更重要的是，通过PTO-Biotin Nps介导的光激活介导的溶酶体功能障碍被发现可显著增强细胞芬顿反应并引起铁中毒，从而提高抗肿瘤疗效并减轻全身副作用。此研究表明，pH响应光热杂嗪组件的分子工程方法能够实现内在铁凋亡机制的时空调节，为开发抗肿瘤治疗中的无金属芬顿诱导剂提供了一种新的策略。
实验结果与讨论
分子设计与合成
恶嗪衍生物是一类具有良好化学/光稳定性和生物相容性的多用途染料，被选择来发展一种时空可控的光热剂。然而，先前报道的恶嗪衍生物(λab < 700 nm)由于其在短波长的组织穿透深度有限，在体内应用仍然有限。一个有效的策略是增加π共轭体系和引入额外的电子给体基团。因此，选择富电子共轭体系10-甲基- 10H -吩噻嗪(PT)作为供体，通过简单的一步脱水缩合合成设计了噻嗪染料PTOC2，并用高分辨质谱学和核磁共振技术在辅助信息中进行了表征。
PTOC2具有最长的吸收波长(λab = 705 nm)，摩尔吸收系数(ε)为30600 M-1cm-1，最大发射点位于840 nm，荧光量子产率(ψ = 0.2%)较低。通过对最高已占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)电子的计算表明，与3,7-双(二乙胺)苯氧杂嗪(Ox-1)相比，PTOC2具有更大的π共轭体系和更明显的不对称振动特性，从而在吸收/发射波长上有明显的红移(Δλab/Δλem = 50/163 nm)和较大的Stokes位移(113 nm)。根据Jablonski图，抑制辐射转变途径可能更有利于产生热量，这一点得到了很好的验证，PTOC2的光热性能和光声成像比Ox-1有更大的改善。事实上，在808 nm激光(1.20 W/cm2)照射下，PTOC2溶液的温度从26.8℃急剧升高到54.3℃，光热转换效率(44.8%)高于常见的近红外光热吲哚菁绿(ICG)(5.25%)。然而，使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为活性氧(ROS)指示剂，没有观察到PTOC2的光动力学性质。值得注意的是，PTOC2的温度升高曲线与其浓度和激光功率密度呈正相关。此外，PTOC2优异的热稳定性、光稳定性、溶解度和pH独立性也得到了证实。上述结果表明，PTOC2具有良好的光热效应，可以作为一种潜在的近红外时空可控剂。
为了将pH响应性引入到光热恶嗪支架中，作者以10H -吩噻嗪为供体构建了酸活化光热剂(PTO2)。正如预期的那样，在中性溶液(pH 7.4)中，由于中性分子相对于PTOC2的分子内电荷转移性质较弱，因此PTO2的最大吸收峰位于615 nm处，如HOMO/LUMO轨道所示。然而，在酸性溶液(pH 4.0, PTO2-H+)中，PTO2的吸收峰红移至750 nm，明显比PTOC2的吸收峰长(λab = 705 nm)。同时，其在808 nm处的保留吸收最大值(71%)明显大于PTOC2(32%)，这有利于长波NIR 808 nm激光的光热活化。计算表明，PtO2-H+中两个芳香族平面之间的二面角较小(θa=−17.86°)，这是由于氢原子的空间位阻效应比甲基小。另一方面，PtO2-H+中HOMO−LUMO的能隙(1.95 eV)小于PtOC2中的能隙(2.02 eV)，这意味着PtO2-H+的波长红移显著。对PtO2在酸性环境中的10H-吩噻嗪基团的去质子化反应(PtO2-H+)也进行了结构表征，并通过1H核磁共振分析进行了验证。此外，作者还发现，与PTOC2相比，PTO2对生物亲核试剂具有更好的化学稳定性，表明其在体内应用中具有良好的实用性。
肿瘤可靶向pH响应组装体的设计、合成和光学性质
值得注意的是，作者发现苯胺氮上不同的烷基取代基(甲基、丙基和戊基)不影响其pKa值(5.4-5.5)，这不仅保证了酸在溶酶体微环境中的激活(4.0-5.5)，而且与已知的溶酶体亲和剂氯喹(pKa 8.4)相比，还降低了溶酶体的碱化。因此，作者进一步设计了聚乙二醇(PEG)链共价附着在PTO2的苯胺氮上，以提高水溶性，增强靶向性。设计并合成了修饰肿瘤靶向生物素组(多种肿瘤细胞中过表达的受体分子)的PTO-Biotin，而不靶向肿瘤的PTO-PEG2K作为对照。不出所料，PEG修饰后其水溶性显著提高。重要的是，PTO-PEG2K和PTO-Biotin的pH敏感性不受PEGylation的影响。PTO-Biotin在pH 4.0-7.0范围内具有比例吸收响应(Ab755nm/Ab630nm)和明显增强的近红外荧光(λem = 848 nm)，pKa值分别为5.65和6.40。此外，作者发现PTO-Biotin仅受pH的可逆活化，在酸性、中性、碱性条件下或多次酸碱循环中具有优异的化学稳定性。随后，对PTO-Biotin在不同pH条件下的比例光声成像(PA755/PA680)和近红外荧光成像进行了验证，表明其在体内成像的潜力很大。在808 nm处光照后，PTO-Biotin溶液的温度随着pH的降低而逐渐升高，在pH 5.0时光热转换效率约为45.5%，表明PTO-Biotin溶液具有良好的酸活化光热性能。此外，动态激光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)证实，两亲性的PTO-Biotin和PTO-PEG2K在水溶液中可以形成稳定的纳米结构组装体(PTO-Biotin Nps和PTO-PEG2K Nps)。由于增强的渗透性和滞留性(EPR)效应，这些组件促进了肿瘤区域的被动靶向。此外，PTO-Biotin Nps也表现出较高的化学稳定性和长期稳定性。综上所述，PTO-Biotin Nps具有生物素的主动靶向和EPR效应的被动靶向，以及pH反应性，是一种很有前景的肿瘤治疗剂。
PTO-Biotin Nps体外抗肿瘤活性研究
为了探讨PTO-Biotin Nps在肿瘤细胞中的作用，首先通过流式细胞术和荧光共聚焦成像技术评估PTO-Biotin Nps在肿瘤(宫颈HeLa，乳腺4T1)和正常(肝细胞HL-7702)细胞中的细胞摄取能力。结果发现，HeLa和4T1细胞(生物素受体阳性)的荧光强度远强于HL-7702 (L02)细胞(生物素受体阴性)，且游离生物素预处理可显著抑制其荧光强度。在其他人类肿瘤细胞(肺癌A549细胞、前列腺癌DU145细胞、肝癌HepG-2细胞)和正常细胞(胚胎肾HEK-293细胞、人肾皮质近端小管上皮HK-2细胞)中也发现了相同的结果。这些结果表明，生物素配体修饰可以提高PTO-Biotin Nps对肿瘤细胞的选择性。此外，他们发现，与非生物素化的对照化合物PTO-PEG2K Nps相比，PTO-Biotin Nps可以加速进入肿瘤细胞，这表明生物素化通过表面过表达的生物素受体在增强肿瘤细胞摄取方面发挥了至关重要的作用。
采用标准MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2- H -溴化四氮唑)法测定PTO-Biotin Nps对多种癌症和正常细胞株的细胞毒性。即使在20 μM的黑暗条件下，PTO-Biotin Nps对所有被测细胞系的细胞毒性也可以忽略不计，这表明PTO-Biotin Nps对正常组织的副作用很小。正如预期的那样，在近红外光照射下，PTO-Biotin Nps对癌细胞的细胞毒性显著增加，这也被钙黄素-AM和碘化丙啶(PI)染料染色的活细胞和死细胞所证明。为了探索近红外光照射下细胞死亡的可能机制，他们在不同细胞死亡途径抑制剂的存在下评估了HeLa细胞的细胞活力，包括铁凋亡、凋亡、自噬和坏死。在加入z-VAD-fmk (一种特定的凋亡抑制剂)或坏死他汀-1 (Nec-1，一种坏死抑制剂)后，细胞活力保持不变，表明非凋亡和非坏死细胞死亡。Western blotting结果显示，它们的代表性生物标志物(如组织蛋白酶D和caspase-3)在近红外光照射下与PTO-Biotin Nps一起培养的细胞中保持不变，进一步证明了一种不同于凋亡和坏死的新的细胞死亡模式。相比之下，只有铁死亡抑制剂(deferoxamine(DFO)和ferrostatin-1 )与未使用抑制剂(细胞存活率≈44%)相比，显著提高了细胞活力(≈62/67%)，这意味着近红外光激活的PTO-Biotin Nps可能诱导了铁死亡。自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤，3-MA)也被发现在提高细胞活力方面发挥部分作用(≈54%)，这表明溶酶体的自噬可能参与了这种死亡模式。
近红外光激活下PTO-Biotin Nps诱导溶酶体功能障碍
为了进一步验证溶酶体参与近红外光激活下PTO-Biotin Nps介导的细胞死亡，作者首先在HeLa细胞和4T1细胞中研究了PTO-Biotin Nps的亚细胞分布。共定位成像结果显示PTO-Biotin Nps具有出色的溶酶体定位能力(P = 0.85)，这可能是由于其质子化和包裹机制类似于溶酶体性化合物和纳米颗粒内吞作用。使用其他细胞器跟踪器进行不同的堆栈扫描和三维成像也证实了这一发现。即使在很长一段时间内，PTO-Biotin Nps仍然可以保持良好的溶酶体定位，这可能是由于PTO-Biotin Nps的溶酶体质子化的酸性，导致其保留在溶酶体中。相比之下，对照化合物PTOC2由于其固有的阳离子亲脂性，主要定位于线粒体(P = 0.79)而不是溶酶体(P = 0.45)。
为了确定PTO-Biotin Nps处理后细胞内溶酶体的功能是否正常，用吖啶橙(AO)作为指标评估溶酶体的完整性。在PTO-Biotin Nps组中观察到大量AO的红色荧光，与其他组(对照组或PTOC2)相比无显著差异。这一发现表明PTO-Biotin Nps的pKa(5.65)不足以影响溶酶体膜的完整性，这可能解释了其低暗毒性。与此形成鲜明对比的是，用PTO-Biotin Nps孵育的细胞在808 nm光照射后，AO的红色荧光完全消失，而对照组(control + 808, PTOC2 + 808)仍然保留AO的红色荧光。这一发现表明，在近红外光照射下，溶酶体靶向的PTO-Biotin Nps通过光热激活细胞诱导LMP。
一旦发生LMP，溶酶体功能障碍的第一个标志之一是将质子释放到细胞质中引发细胞内酸化，这对细胞有害。为了确定近红外光激活的PTO-Biotin Nps是否会影响细胞内酸度，作者用商业pH指示剂(BCECF-AM)测量了癌细胞的细胞内pH。只有在近红外光照射下用PTO-Biotin Nps孵育的细胞中才观察到较低的绿色荧光信号，而在PTOC2或PBS孵育的细胞中则没有。根据不同细胞内pH值的BCEF-AM荧光定量， PTO-Biotin Nps处理的细胞在近红外光照射后的细胞内pH值明显下降到6.24±0.29，而在没有近红外光照射的情况下，细胞内pH值接近中性(7.43±0.07)。这一发现证明近红外光激活PTO-Biotin Nps可通过溶酶体功能障碍引发细胞内酸化。
作为溶酶体的重要功能之一，自噬导致细胞内各种底物的降解，如铁蛋白。因此，作者进一步检测了PTO-Biotin Nps处理后细胞内自噬途径中关键标记蛋白的表达。Western blotting结果显示，在近红外光照射后，PTO-Biotin Nps培养的细胞中，细胞内LC3-II蛋白(自噬的关键标记蛋白)的表达上调，提示自噬体积累。此外，在近红外光照射PTO-Biotin Nps培养的细胞时，作者还发现p62蛋白(自噬通量受损的关键标志)过表达，导致自噬严重受损。这一发现与自噬抑制剂可以影响PTO-Biotin Nps的光毒性这一事实是一致的。因此，这些数据证实了近红外照射PTO-Biotin Nps可以触发自噬体的积累并损害自噬，进一步证明了溶酶体功能障碍。
近红外光激活下PTO-Biotin Nps诱导的内源性Fenton化学诱导铁凋亡
为了进一步测试近红外光激活PTO-Biotin Nps引发的溶酶体功能障碍是否与铁死亡的发生有关，他们进行了额外的研究来研究铁死亡的特征。细胞ROS和脂质过氧化(LPO)的积累被认为是铁死亡的重要标志。因此，他们使用一种完善的细胞内ROS探针(2',7'-二氯荧光素双醋酸酯，DCFH-DA)检测细胞内ROS水平。成像结果显示，在近红外光照射下，与对照细胞或n -乙酰半胱氨酸(NAC，一种常见的ROS抑制剂)预处理相比，PTO-Biotin Nps处理的HeLa细胞的绿色荧光增强，这为ROS水平升高提供了有力的证据。流式细胞术分析也证实了这一发现。
随后，使用商用•OH指示剂(香豆素-3-羧酸，3-CCA)进行共聚焦成像，以检测•OH水平(传感机制见图)，是铁死亡中具有代表性的ROS。作者发现3-CCA在黑暗中的荧光可以忽略不计，但在近红外光照射下荧光明显增强。进一步的研究表明，用铁死亡抑制剂铁抑素-1 (fer1)预处理细胞可显著降低ROS和•OH水平。相比之下，使用单线态氧传感器绿色(SOSG)作为1O2的特异性指标，没有观察到1O2的产生，这表明PTO-Biotin Nps不具有细胞内光动力学性质。这些数据表明，近红外光激活PTO-Biotin Nps诱导细胞内•OH生成是通过增强Fenton反应导致铁死亡的重要机制。同时，在近红外光照射后，未发现线粒体靶向化合物PTOC2能提高•OH水平，这表明溶酶体靶向的PTO-Biotin Nps光热活化在提高细胞内•OH水平方面发挥了作用。此外，PTO-Biotin Nps溶液经近红外光照射后，体外未观察到包括•OH和1O2在内的ROS生成。综上所述，这些结果表明细胞内•OH的生成不是由近红外光照射PTO-Biotin Nps直接产生的，可能是由于光热效应引发细胞内溶酶体功能障碍，从而促进Fenton反应，进而引发铁凋亡。
为了确定这种死亡机制，作者使用Liperfluo(一种商用LPO测定法)来研究脂质过氧化水平，这是铁死亡的一个重要标志。成像实验显示，PTO-Biotin Nps在808 nm光照射下显著增强Liperfluo荧光，提示明显的脂质过氧化积累。另一方面，Western blot显示PTO-Biotin Nps + NIR辐照处理的细胞中GPX4(另一个与铁中毒相关的关键特征大幅下调，表明铁中毒中大量脂质氧化消耗了GPX4。此外，细胞内丙二醛(MDA)是LPO的重要终产物，对铁死亡有正向调节作用，当细胞接受PTO-Biotin Nps + NIR照射时增加。上述结果表明，近红外光激活的PTO-Biotin Nps可触发LMP和随后的溶酶体功能障碍，从而进一步促进细胞内在的Fenton机制，引起铁ptosis。
PTO-Biotin Nps体内抗肿瘤活性研究
PTO-Biotin Nps的肿瘤靶向特性首先通过近红外荧光和PA成像进行了检测。注射PTO-Biotin Nps后，肿瘤部位的荧光信号在9 h左右逐渐增加，达到最大值，然后逐渐降低，这有利于确定肿瘤区域近红外光激活的最佳时间点。相比之下，对照化合物PTO-PEG2K Nps在肿瘤中的荧光信号增强可忽略不计，并在12 h后消失，这表明PTO-Biotin Nps比非生物素化的PTO-PEG2K Nps具有更好的肿瘤靶向性能。由于PA成像的成像深度比荧光成像更深，因此也证实了深部肿瘤的富集效果。与荧光成像一致，PTO-Biotin Nps在肿瘤部位的PA强度(PA755和PA680)随着时间的推移显着增加，高于注射PTO-PEG2K Nps的小鼠。这些结果表明PTO-Biotin Nps具有双重肿瘤靶向(主动靶向生物素和被动靶向EPR效应)的优势。因此，PTO-Biotin Nps适用于近红外荧光和PA成像引导治疗。此外，注射24 h后肿瘤和主要器官的离体荧光图像进一步证实了PTO-Biotin Nps增强的肿瘤富集和保留特性。接下来，在健康小鼠中评估PTO-Biotin Nps的生物安全性，以确保体内治疗具有低全身毒性。静脉注射24 h后取大鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)及血液进行H&E染色分析及生化评价。与给予生理盐水的小鼠类似，给予PTO-Biotin Nps的小鼠未观察到明显的组织病理学或生理损伤，表明PTO-Biotin Nps的试验剂量没有可检测到的毒性。
利用PTO-Biotin Nps的这些有利特性，研究人员进行了研究，以确定它们对携带4T1肿瘤的小鼠的治疗效果。他们首先通过瘤内注射探索其治疗效果。在808 nm光照射下，PTO-Biotin Nps (i.t)的抑瘤效果明显优于预注射抑制剂Fer-1 (i.t)组或pto2 (i.t)组，提示光热与铁下垂在体内具有协同抑制肿瘤生长的作用。治疗24 h后，肿瘤组织DCFH-DA和LPO染色结果也证实了PTO-Biotin Nps中铁死亡的标志。此外，通过静脉注射(i.v.)评估抗肿瘤效果;将小鼠随机分为PBS、PBS +激光、PTO-Biotin Nps(静脉注射)和PTO-Biotin Nps(静脉注射)+激光4组。对两组小鼠在808 nm激光照射下，在红外摄像机上进行实时热成像。PTO-Biotin Nps +激光组的肿瘤温度在10 min内从33.3℃显著升高到49.4℃(ΔT = 16.1℃)，而PBS +激光组的肿瘤温度仅升高到41℃，低于损伤阈值温度。这些结果证明了PTO-Biotin Nps的高效体内光热性能。随后，每隔一天记录各组小鼠的形态变化和肿瘤体积变化，连续16天。值得注意的是，PBS、PBS +激光和PTO-Biotin Nps组的肿瘤生长迅速，而PTO-Biotin Nps +激光组的肿瘤明显受到抑制，这表明PTO-Biotin Nps的近红外光激活通过触发溶酶体功能障碍介导的铁ptosis而大大增强了抗肿瘤作用。重要的是，各组小鼠的体重和行为差异很小。治疗后，对切除的肿瘤进行称重、拍照，并用H&E染色进行组织学评估。显然，只有PTO-Biotin Nps +激光组出现了肿瘤组织的重大损伤，而其他组的损伤迹象可以忽略不计。肿瘤组织LC3和p62免疫荧光染色显示，PTO-Biotin Nps +激光组LC3和p62的表达明显升高，显示溶酶体功能障碍自噬受损。PTO-Biotin Nps +激光组GPX4显著下调，进一步证实PTO-Biotin Nps +激光组GPX4显著增强的抗肿瘤作用归因于铁氧化介导的机制。此外，各组小鼠主要器官的H&E染色评估，与PBS组相比无明显变化。此外，他们还对常见的肝脏和肾脏生物标志物进行了血液生化分析，这进一步证明了由于肿瘤中PTO-Biotin Nps独特的时空可激活特性，小鼠的肝脏和肾脏毒性可以忽略不计。综上所述，这些发现表明PTO-Biotin Nps可以通过光触发溶酶体功能障碍引起肿瘤铁死亡，从而增强局部抗肿瘤作用并减少全身毒性。
结论
作者成功设计了一种新的pH响应恶嗪自组装纳米粒子(PTO-Biotin Nps)，它可以通过近红外光触发的固有铁死亡机制来时空控制铁死亡抗肿瘤治疗。在他们的方法中，PTO-Biotin Nps具有酸激活的光热特性，并通过生物素活性靶向和EPR效应在肿瘤中表现出增强的积累。重要的是，我们证明了这种无金属组装提供了一种无创控制策略，可以促进内源性芬顿反应，通过溶酶体功能障碍引发强烈的铁凋亡，导致细胞质酸化和自噬受损。因此，该组合获得了强大的抗肿瘤功效和最小的非肿瘤毒性。本研究不仅为实现高时空精度的铁死亡按需、无创控制的分子组装工程策略铺平了道路，而且为未来开发无金属的铁下垂诱导剂以增强铁下垂依赖的抗肿瘤治疗提供了新的途径。
参考文献
Molecular Engineering of pH-Responsive NIR Oxazine Assemblies for Evoking Tumor Ferroptosis via Triggering Lysosomal Dysfunction . Wei Li, Shulu Yin, Yang Shen, Haiyan Li, Lin Yuan,* and Xiao-Bing Zhang*. J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 3736−3747. https://doi.org/10.1021/jacs.2c13222
