内容提要
光疗因其在改变传统癌症治疗策略方面的巨大潜力而受到持续关注。然而，大多数多组分光治疗系统的复杂性、可重复性差、光治疗输出不足以及不可避免地对正常组织造成损伤，严重阻碍了其临床应用。因此，探索具有多功能的“一刀切”智能光治疗剂仍然是一项极具吸引力但又极具挑战性的任务。本文采用分子工程技术，巧妙地设计了一种具有聚集诱导发射特性的利用pH可逆控制的近红外第二光敏剂，用于精确靶向肿瘤的荧光成像引导光疗。由于DTTVBI具有较强的分子内电荷转移，增强了高效的体系间交叉和充分的分子内运动，在808 nm激光照射下，DTTVBI具有促进i型超氧阴离子自由基生成和优异的光热性能。更重要的是，具有高生物相容性的DTTVBI纳米颗粒在肿瘤区域表现出显著增强的i型光动力/光热治疗，从而在体外和患者来源的结肠癌肿瘤异种移植模型中都具有显著的抗肿瘤作用。这项工作为开发优越的多功能光疗治疗癌症提供了新的思路。
结果与讨论
分子设计、合成和理论计算
TTVBI、DTVBI和DTTVBI的合成路线见方案S1的“支持信息”部分。关键中间体苯并[c,d]吲哚2是一种适用于菁染料的终端单元，具有很强的电子接受能力。用Suzuki偶联反应可以很容易地合成给电子部分3。然后在二苯胺和2-溴噻吩之间进行Buchwald - Hartwig偶联反应，以71%的收率得到给体桥4。随后，在- 78℃下用正丁基锂和二甲基甲酰胺进行4的甲酰化反应，得到供体5。用二乙基(2-甲基噻吩)膦酸盐进行了高效的Horner - Wadsworth - Emmons烯化反应，扩展了给体5的π共轭，得到了收率高达95%的给体桥6。最强的给体7是由给体桥6甲酰化得到的，产率中等。有了给体3、5和7，在三乙胺和乙酸酐存在的乙酸溶液中，与苯并[c,d]吲哚2受体的最终Knoevenagel缩合反应顺利进行，得到TTVBI、DTVBI和DTTVBI，产率分别为40%、22%和45%。
为了深入了解TTVBI、DTVBI和DTTVBI的几何和电子性质，作者在M06-2X/6-311G(d,p)水平上进行了时间依赖密度函数理论(TD-DFT)计算，以获得优化的单重态几何形状。TTVBI和DTVBI的最低未占据分子轨道(LUMO)的电子分布主要在噻吩和苯并[c,d]吲哚环上都有离域，而DTTVBI的LUMO仅在苯并[c,d]吲哚环上有离域。此外，DTTVBI的最高已占据分子轨道(HOMO)主要分布在由二苯胺和两个噻吩片段组成的供体-桥上，表明与TTVBI和DTVBI相比，DTTVBI具有更强的D - A相互作用和分子内电荷转移效应，这些结果也通过TTVBI (2.88 eV)、DTVBI (3.72 eV)和DTTVBI (2.75 eV)的计算能隙(ΔEg)得到验证。此外，TTVBI、DTVBI和DTTVBI的单重态和三重态之间的能隙(ΔEst)分别小至0.002、0.154和0.004 eV，揭示了它们在ROS生成中的巨大潜力。此外，作者还计算了重组能(λ)来评估单重态和基态几何之间的内在变化。DTTVBI的总λ(13716 cm−1)远大于DTVBI(9380 cm−1)和TTVBI(6024 cm−1)，表明DTTVBI具有更强的分子内运动。值得注意的是，二面角的变化对三种分子的总λ的贡献最大，分别为71.84、77.24和84.11%。计算结果表明，由于高效的ISC过程和剧烈的分子运动，制备的三种分子有望具有协同的PDT和PTT。
光物理性质
采用紫外-可见-近红外光谱和光致发光(PL)光谱系统地研究了TTVBI、DTVBI和DTTVBI的光学性质。它们在二甲亚砜(DMSO)中的吸收最大值分别在660、694和750 nm处达到峰值。特别是，DTTVBI表现出非常宽的吸收范围从600到900 nm，即使在长波如808 nm也具有很高的吸收率。DMSO中TTVBI、DTVBI和DTTVBI的最大发射峰分别位于1002、781和1114 nm，这与基于优化单重态几何理论计算的能带隙完全一致。由于TTVBI和DTTVBI的主要发射区位于NIR- ii区，因此它们有望利用近红外激光激发实现NIR- ii型荧光引导光疗。然后，作者研究了它们在不同甲苯组分的DMSO/甲苯混合物中的荧光特性。TTVBI和DTTVBI的排放强度随甲苯馏分的增加而明显增加，在90%甲苯馏分时达到最大值。当甲苯分数达到95%时，TTVBI和DTTVBI的荧光强度略有下降，但仍是溶液状态下的3.0倍和2.2倍，牢固地表现出典型的AIE特征。在DTVBI中观察到明显的ACQ现象，这可归因于其平面性引起的聚集态π−π堆积。
为了验证分子在近红外激光照射下的潜在协同光疗作用，在第一步，作者以2 '，7 '二氯荧光素(DCFH-DA)为指标评估了总ROS生成能力。三种分子在生成ROS的速度和效率上都有显著差异。在660nm激光照射下，TTVBI存在50s后，DCFH的荧光强度迅速增强到初始的近300倍。
而对于DTVBI和DTTVBI分子，在660 nm和808 nm激光照射10 min后，DCFH的荧光强度分别缓慢增加到近500倍和450倍。一般认为，当最低三态激发态(T1)能高于氧敏化阈值时，PS倾向于通过ii型过程快速生成单线态氧(1O2)，而不是通过i型过程快速生成羟基自由基(•OH)和超氧阴离子自由基(O2•−)。利用市购单重态氧荧光探针(ABDA)、超氧阴离子探针(DHR123)和羟基自由基探针(HPF)进一步鉴定TTVBI、DTVBI和DTTVBI产生的ROS的种类。在660 nm激光照射下，TTVBI和DTVBI存在时，ABDA的吸收信号明显下降，分别为65%和73%，而DTTVBI加808 nm激光照射时，ABDA的吸收信号变化不大，说明DTTVBI产生1O2的能力较差。在TTVBI、DTVBI和DTTVBI存在的情况下，激光照射下DHR 123的荧光强度分别达到照射前的6.3、4.3和13.5倍以上，而仅DHR 123组的荧光强度没有明显增强，说明DTTVBI的O2•−生成效率明显较高。此外，在TTVBI和DTVBI的情况下，HPF的PL强度分别达到了660 nm激光照射前的50倍和55倍左右，反映了它们突出的•OH生产效率。在808 nm激光照射下，DTTVBI + HPF组和仅HPF组均没有明显的荧光增强，反映了它们较差的•OH生成效率。
为了进一步确认O2•−的生成，以5,5二甲基-1-吡咯啉- n-氧化物(DMPO)为自旋诱捕剂，进行了电子自旋共振(ESR)测量。
在DTTVBI和DMPO存在的情况下，808 nm激光照射5 min后的ESR光谱中出现了明显的由DMPO-O2•−加合物产生的6线ESR信号。然后，通过温度随辐照时间的变化记录了三种分子在DMSO溶液中的光热转化行为。在适当的激光照射360 s后，分子的温度迅速升高并达到稳定，其产热效率依次为DTTVBI > DTVBI > TTVBI。其中，在808 nm激光照射下，200 μM DTTVBI溶液在85℃时温度最高，温度升高60℃(ΔT)，远高于660 nm激光照射下的DTVBI (ΔT≈43℃)和TTVBI (ΔT≈41℃)。
DTTVBI NPs的表征与性能
DTTVBI的激发和发射波长长，ROS生成能力强，光热转换效率高，无疑是一种很有前途的i型PDT/PTT试剂，可用于NIR-II i -FI引导的治疗应用。然而，理想的PS不仅应该有效地杀死癌细胞，而且对正常组织和细胞的毒性可以忽略不计。此外，通过溶剂-超声纳米沉淀法将DTTVBI组装成NPs，评估DTTVBI NPs的生物安全性和pH可逆性。使用生物相容性两亲性DSPE-mPEG2000共聚物和FDA批准的PLGA作为包封基质制备DTTVBI NPs，包封效率为64%。与DMSO溶液相比，制备的NPs的UV - vis - NIR吸收光谱和荧光光谱显示了50 nm的蓝移，分别位于696和1050 nm。DTTVBI NPs在水中具有良好的分散性，动态光散射(DLS)测量的直径为~ 160 nm，透射电子显微镜(TEM)检测到的均匀球形。
此外，DTTVBI NPs在磷酸盐缓冲盐水(PBS)和PBS加10%胎牛血清(FBS)溶液中均表现出良好的环境条件下7天的储存稳定性，粒径变化可以忽略不计。
随后，作者利用紫外-可见-近红外光谱研究了DTTVBI NPs对Britton - Robinson (40 mM)缓冲液pH变化的吸收响应。随着pH值从4.0增加到10.0,DTTVBI NPs的最大吸收在415 nm处逐渐增加，在696 nm处显著降低。I415/I696与pH在6.0 ~ 8.0范围内的线性关系很好，计算出的pKa值为6.94。当pH值在4.0和10.0之间循环调节，BR缓冲液中肉眼可见的颜色在深绿色和淡黄色之间变化时，DTTVBI NPs表现出令人满意的可逆性。值得注意的是，以IR-26 (QY = 0.5%)为参考，确定DTTVBI NP水溶液在900 ~ 1400 nm发射范围内的量子产率(QY)高达0.61%，几乎是DMSO溶液(0.30%)的两倍，进一步证明了DTTVBI的AIE倾向。为了验证DTTVBI NPs作为智能PS的潜力，进一步评估了DTTVBI NPs在pH 6.5和7.4下的ROS和产热能力。在pH = 6.5的808 nm激光照射下，DTTVBI NPs存在下，DCFH的荧光强度在600 s后迅速增加到开始时的近130倍，而在pH = 7.4时对比明显，强度没有明显增强，说明在正常生理pH值下ROS的产生可以忽略不计。在pH = 6.5的808 nm激光照射下，在200 μM DTTVBI NPs存在下，温度迅速从25℃上升到65℃(ΔT = 40℃)。即使在浓度为200 μM、最高平台温度低于43℃、pH = 7.4时，也只产生轻微的热，对正常组织没有造成非特异性损伤。根据热-冷循环计算，DTTVBI NPs的光热转换效率高达45.8%。此外，DTTVBI NPs在连续6个808 nm激光开启和激光关闭周期后具有良好的光热稳定性，变化可以忽略不计。
体外肿瘤杀灭研究
由于DTTVBI NPs具有高效的i型ROS生成和出色的光热性能，利用CCK-8法评估了DTTVBI NPs对HCT 116癌细胞的体外协同光疗效果。DTTVBI NPs对HCT 116细胞的细胞毒性可以忽略不计，即使在黑暗条件下浓度为50 μg mL−1，表明其具有良好的生物相容性。在808 nm激光照射下，在DTTVBI NPs存在的情况下，HCT 116细胞的活力呈剂量和时间依赖性显著下降。为了更直观地显示DTTVBI NPs的光疗效果，采用双醋酸荧光素(FDA)/碘化丙啶(PI)双染色方法分别区分活(绿色)和死(红色)HCT 116细胞。三个对照组(仅PBS、PBS +激光、仅DTTVBI NPs)只观察到绿色荧光，进一步证明了NPs具有良好的生物相容性。相比之下，808 nm激光(DTTVBI NPs +激光组)照射7 min，观察HCT 116细胞的凋亡情况。为了确认DTTVBI作为智能光治疗剂的应用潜力，比较了相同条件下HCT 116癌细胞和正常3T3细胞的细胞活力。经50 μg mL−1 DTTVBI NPs处理的HCT 116细胞，在808 nm激光，相比之下，在上述所有条件下，均未观察到明显的对3T3细胞(约92.4%)的细胞毒性。同样，在pH 7.4条件下，DTTVBI NPs对HCT 116细胞的光毒性在光照后显著降低。造成这种差异的主要原因是在正常组织pH值下，DTTVBI NPs会逐渐转化为DTTVBI-OHNPs的失活形式。DFT计算表明，碱型DTTVBI-OH的HOMO和LUMO之间的能隙(ΔEg)为4.94 eV，远高于酸型DTTVBI的2.75 eV，导致吸收峰发生明显的蓝移。因此，在808 nm照射下，DTTVBI-OH NPs不能被激发到S1态，导致ROS和产热较差。不同浓度(甚至高达50 μg mL−1)培养24 h，未观察到RAW 264.7细胞存活率的显著下降，表明DTTVBI NPs具有较低的暗细胞毒性。
为了证实i型PS在实体肿瘤中的抗缺氧能力，评估了常氧和缺氧环境下HCT 116细胞中DTTVBI NPs的ROS生成。使用DCFH-DA作为总ROS指标，即使在严重缺氧条件下(2% O2)也能观察到亮绿色荧光。此外，利用荧光指示剂二氢乙锭(DHE)评价了正常氧(21% O2)和缺氧(2% O2)下活细胞O2•−的形成。与常氧组相比，缺氧组DHE的红色荧光强度略有下降，说明DTTVBI NPs在体外仍具有令人满意的O2•−生成能力，说明DTTVBI NPs在激光照射下能够生成O2•−，部分O2•−随后通过细胞内级联Haber−Weiss和Fenton反应转化为其他细胞毒性氧化剂(•OH、H2O2等)，克服肿瘤缺氧。相比之下，缺氧条件下TTVBI NPs的ROS生成明显下降。
光治疗实体肿瘤不仅依赖于PTT和PDT的特性，还依赖于PSs在肿瘤部位的富集和分散作用。然而，二维细胞培养无法模拟这种生理状态，因此使用结肠癌类器官模型来观察DTTVBI NPs在三维培养条件下对肿瘤细胞的杀伤作用。正如预期的那样，在结肠癌类器官模型中，在808 nm激光照射下，DTTVBI NPs消融的肿瘤细胞在三维空间中均匀分布，而在相同条件下，对照组几乎没有发生凋亡。上述类器官实验结果与细胞实验结果吻合，进一步说明DTTVBI NPs +激光在体外具有较强的杀伤癌细胞能力。
患者源性肿瘤异种移植小鼠模型的体内成像和协同治疗
由于DTTVBI NPs在体外具有令人印象深刻的光疗性能，进一步评估了DTTVBI NPs在携带PDX小鼠中的抗肿瘤功效。小鼠实验流程如图所示。治疗15天后，处死小鼠进行分析。首先，通过静脉给药DTTVBI NPs对携带PDX的小鼠进行体内NIR-II FLI。注射DTTVBI NPs前未观察到明显的信号，这是由于NIR-II窗口内组织自身荧光减弱，信噪比高所致。静脉注射DTTVBI NPs后，肿瘤部位的NIR-II FLI荧光信号在3 h开始出现，随着时间的推移，荧光信号强度逐渐增加，在注射后12 h达到最大，说明DTTVBI NPs具有显著的肿瘤靶向能力，这可能与DTTVBI NPs增强的通透性和滞留作用有关。此后，由于NPs的代谢，NIR-II荧光强度随着时间的推移逐渐降低。
为了验证DTTVBI NPs的PTT潜力，在808 nm激光照射下对携带PDX的小鼠进行体内光热评估。静脉注射DTTVBI NPs 12 h后，利用红外热像仪实时清晰记录肿瘤区域快速升温过程。DTTVBI np给药小鼠肿瘤区域温度在2 min内从36.3℃迅速升高到50.4℃，808 nm激光照射7 min后达到59.6℃左右的平台温度，揭示了DTTVBI NPs光疗应用的巨大潜力。相比之下，注射PBS的小鼠只观察到轻微的升高(ΔT = 4.4°C)，表明仅808 nm激光对温升的影响可以忽略不计。
随后，将携带PDX的小鼠随机分为4个治疗组:(G1) PBS;(G2)激光;(G3) DTTVBI NPs;(G4) DTTVBI NPs +激光。采用808 nm激光照射。在治疗15 d期间，四组每3天测量一次肿瘤体积。
PBS、DTTVBI NPs和激光组的肿瘤在不同治疗结束时迅速生长，最大体积超过600 mm3。与此形成鲜明对比的是，DTTVBI NPs +激光组在治疗后15 d内，肿瘤生长抑制显著，抑制率高达80%，在体内表现出令人满意的光疗效果。在15天的治疗过程中，没有观察到治疗引起的体重和小鼠死亡的实质性变化，初步证明了DTTVBI NPs具有良好的生物相容性。此外，在DTTVBI NPs +激光组获得的切除肿瘤的苏木精-伊红(H&E)图像中，观察到治疗引起的核染色最广泛的损失。综上所述，本研究结果表明，在PDX小鼠模型中，协同PTT和i型PDT具有出色的杀瘤性能。
对健康BALB/c裸鼠静脉注射PBS或DTTVBI NPs，激光开启或关闭30 d后，进一步进行血液分析和主要脏器H&E染色，评价其生物安全性。主要脏器H&E染色图像无病理差异，说明DTTVBI NPs具有较低的全身毒性。与PBS对照组相比，其他3个实验组的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总血尿素氮、肌酸等血液生化指标均在正常范围内，差异无统计学意义，从而更有说服力地证实了DTTVBI NPs的低全身毒性和副作用。
结论
作者精心设计了一种具有聚集诱导NIR-II发射倾向的可逆pH切换光治疗剂。DTTVBI具有较强的电子D−A相互作用、较小的ΔEST和充分的分子内运动特性，在808 nm激光照射下表现出极高的i型ROS生成和优异的光热性能，而这些特性在酸性肿瘤微环境中可以通过其显著的可逆pH切换性得到显著提升。因此，生物相容性DTTVBI NPs在NIR-II FLI引导的i型PDT/PTT体外和携带pdx的小鼠模型中均表现良好，提供准确的肿瘤成像和显著的肿瘤生长抑制，同时几乎没有副作用。这一贡献提供了一种新的智能光治疗剂设计策略，对刺激光治疗平台进入临床试验具有重要意义。
参考文献
De Novo Design of Reversibly pH-Switchable NIR-II Aggregation-Induced Emission Luminogens for Efficient Phototheranostics of Patient-Derived Tumor Xenografts. Peihong Xiao, Wei Xie, Jianyu Zhang, Qian Wu, Zipeng Shen, Chenqi Guo, Yi Wu, Fubing Wang, Ben Zhong Tang, and Dong Wang. Journal of the American Chemical Society 2023 145 (1), 334-344. DOI:10.1021/jacs.2c10076
