内容摘要
化学动力疗法(CDT)是一种理想的治疗方式，内源性H2O2作为刺激。大多数细胞内H2O2补充策略提高CDT效率都强烈依赖于氧参与，肿瘤微环境的缺氧损害了它们的性能。在这里，作者开发了一种自组装的金属有机配位纳米粒子Cu-OCNP /Lap，通过NIR-II增强细胞内循环反应来提高CDT效率。Cu2+为节点，1,4,5,8-四羟基蒽醌(THQ)和BanoxantroneDihydrochloride (AQ4N)为配体，β-Lapachone (β-Lap)负载进行胞内循环反应，合成了Cu-OCNP/Lap。Cu-OCNP/Lap在NIR-II窗口具有良好的光热效应，相应的局部温度升高使肿瘤部位血流加快，供氧充足，β-Lap循环反应增强，产生大量H2O2。Cu+在谷胱甘肽(GSH)作用下由Cu-OCNP/Lap释放并触发CDT。细胞内充足的H2O2供应增强CDT效应，对肿瘤生长有良好的抑制作用。该设计为提高CDT效率提供了一种有前景的策略。
结果与讨论
通过Cu2+与AQ4N和THQ的C=O/C-O基团的金属有机配位作用合成了Cu-THQ/AQ4N自组装配合物，该配合物呈球状结构，粒径为47±4.7 nm，水动力直径为66±3.8 nm。zeta电位为15±1.6 mV和从可见光到NIR-II区覆盖的宽吸收带。Cu2+与AQ4N/THQ成功配位后，在1604 cm-1处的C=O特征峰比在1534 cm−1处的C—N特征峰下降。ICP-MS法测定Cu-THQ/AQ4N中Cu2+含量为142 ng/mg。N2吸附-脱附等温实验表明，Cu-THQ/AQ4N的比表面积为78 m2/g，孔径为1.59 nm，适合β-Lap负载。通过π-π叠加和疏水相互作用将疏水β-Lap加载到Cu-THQ/AQ4N中，然后通过配位相互作用将氨基末端的PEG-FA偶联得到Cu-OCNP /Lap。Cu-OCNP/Lap的粒径为53±3.1 nm，水动力直径为90±3.6 nm，在258 nm处表现出β-Lap的特征吸收。β-Lap在Cu-OCNP /Lap中的加载量和加载效率分别为19.4%和76.5%。在没有β-Lap加载的情况下，Cu-OCNP的FT-IR光谱证实PEG-FA与Cu-THQ/AQ4N成功偶联，分别在2935 cm−1和1097 cm−1处出现PEG特征吸收峰，对应于C-H和C-O-C的伸缩振动。Cu-OCNP的zeta电位为−6±1.4 mV，X射线光电子能谱(XPS)中C和O的特征峰强度在284.8 eV和531.7 eV处增强。Cu-OCNP /Lap与含10%牛血清的细胞培养液DMEM孵育24 h后，AQ4N荧光稳定，颗粒大小不变，表明Cu-OCNP/Lap具有令人满意的稳定性。
由于光诱导电子转移(PET)机制，Cu-OCNP中的Cu2+可以促进AQ4N和THQ的非辐射跃迁，从而提高了光热效应。AQ4N和THQ的荧光猝灭效率分别约为97.4%和98.5%。Cu-OCNP的光热性能通过检测溶液的温度变化来测量，其浓度依赖性增加，200 μg/mLCu-OCNP在600 s内达到44℃。相比之下，200 μg/mL Cu-THQ。
协同复合体在600 s内仅升高28℃，表明AQ4N对Cu-OCNP光热效应的贡献。此外，Cu-OCNP表现出优异的光热转换效率为68.5%。Cu-OCNP中Cu在激发态向荧光团AQ4N和THQ的光诱导电子转移猝灭了它们的荧光，提高了光热转换效率。其光热转换效率优于以往报道的铜基光热剂。此外，Cu-OCNP具有良好的热稳定性。
GSH将Cu2+还原为Cu+，并相应地减弱了其与AQ4N/THQ的协同作用，使AQ4N荧光恢复迅速，AQ4N在60 min释放96±1.7%，Cu-OCNP溶液颜色由浅紫变为深紫。用ICP-MS根据时间监测铜释放，60 min铜释放量达到97±2.1%。在Cu-OCNP降解过程中，其形态随时间继续膨胀，多分散性指数(PDI)变宽。60 min时，Cu/OCNP的纳米颗粒结构完全消失，表明Cu/OCNP完全分解。经GSH处理的Cu-OCNP的XPS分析表明，Cu2p1/2和Cu2p3/2的结合能分别从954.0和933.9向933.5 eV轻微偏移。Cu2+的卫星峰在GSH处理后也消失了，证实了GSH将Cu2+还原为Cu +。GSH对Cu - ocnp的响应性降解和相应的Cu+的充分释放保证了类Fenton反应。在没有GSH的情况下，Cu-OCNP在pH7.4时表现出良好的稳定性，在pH 6.5时略有降解和5.0时略有降解。释放的Cu+催化H2O2存在下的类Fenton反应产生•OH，降低了亚甲基蓝(MB)的吸光度(Cu-OCNP)。相反，在pH为6.5时，MB在GSH存在下表现出稳定的吸光度(GSH)。电子自旋共振(ESR)光谱进一步证实了以5,5-二甲基-1-吡咯烷-氧化物(DMPO)为•OH捕获剂的•OH生成，并表现出1:2:2:1的特征四重峰信号( Cu-OCNP)。1064 nm光辐照进一步促使•OH产生，MB降解增强( Cu-OCNP (NIR-II))，ESR光谱中四重峰信号强度增强( Cu-OCNP (NIR-II))。
Cu-OCNP与HeLa细胞培养,细胞内AQ4N荧光逐渐恢复随着时间Cu-OCNP的还原。相反,GSH清除试剂N-ethylmaleimide (NEM)治疗海拉细胞表现出弱荧光恢复AQ4N即使8 h孵化,表明其对GSH的降解特异性。Cu-OCNP降解后，Cu+被释放，并与细胞内H2O2反应触发CDT。HeLa细胞在1% O2的低氧条件下培养，模拟肿瘤微环境，用ROS探针2'，7'-二氯荧光素二醋酸酯(DCFH-DA)测量生成的•OH。β-Lap利用肿瘤细胞过表达(NAD(P)H):(NQO1)酶，与其还原产物对苯二酚发生循环反应，将O2转化为H2O2，促进了•OH的生成。因此，与Cu-OCNP孵育HeLa细胞( Cu-OCNP/Lap，缺氧)相比，Cu-OCNP孵育HeLa细胞( Cu-OCNP，缺氧)表现出更强的DCHF-DA胞内绿色荧光。然而，氧气供应不足仍然限制了β-Lap循环反应的效率，从而损害了细胞内H2O2的生成。充足的氧气供应促进β-Lap循环反应，Cu-OCNP /Lap孵育HeLa细胞。
在氧气含量为21%的常氧条件下，细胞内•OH生成更强烈，DCFH-DA绿色荧光更强(Cu-OCNP/Lap，常氧条件下)。Cu-OCNP的光热效应进一步辅助CDT，增强•OH生成，胞内绿色荧光最强(Cu-OCNP/Lap(NIR II)，常氧)。流式细胞术分析还显示，在NIR-II光照射下，Cu-OCNP/Lap培养的HeLa细胞在常氧环境下产生最强的DCHF-DA荧光。通过测定细胞内H2O2水平，也证实了充足的氧气供应能有效地生成H2O2。Cu-OCNP/Lap孵育的细胞与Cu-OCNP孵育的细胞相比，H2O2探针ROS Green的绿色荧光更强(缺氧)。相比之下，在常氧条件下，Cu-OCNP/Lap培养细胞的ROS Green荧光增强更强(Cu-OCNP /Lap，常氧条件下)，表明充足的氧气供应促进了β-Lap循环反应和细胞内H2O2积累。
流式细胞术分析也显示Cu-OCNP/Lap在常氧条件下培养的细胞具有更强的ROS Green荧光趋势。在CDT的伴随下，Cu-OCNP/Lap降解过程中GSH的消耗也减轻了肿瘤的抗氧化防御。用降低的GSH检测试剂盒检测细胞内GSH水平的下降，结果显示，与未处理的HeLa细胞相比，在没有和存在1064 nm光照的情况下，Cu-OCNP/Lap孵育的HeLa细胞的GSH水平分别为49±2.1%和35±2.3%。
采用MTT法评价Cu-OCNP/Lap的抗癌作用。Cu-OCNP/Lap孵育的HeLa细胞在低氧环境下的细胞存活率为52±3.1%(第3栏)，而Cu-OCNP孵育的HeLa细胞(第2栏)由于β-Lap循环反应中细胞内H2O2的补充，细胞存活率为64±1.8%。相比之下，Cu-OCNP/Lap在常氧环境下培养HeLa细胞，细胞存活率为21±4.2%(第5栏)。充足的氧气供应强化了β-Lap循环反应，并促进了β-Lap循环反应。
CDT的效果。在1064nm光照射下，Cu-OCNP /Lap的光热效应进一步抑制细胞活力至8±4.6%(第6栏)，表明Cu-OCNP/Lap具有显著的抗癌能力。此外，NEM对HeLa细胞进行预处理，抑制细胞内GSH水平，Cu-OCNP/Lap在NIR-II光下孵育时，GSH水平约为67%。这表明纯PTT对细胞活力的影响(第8栏)。活/死细胞试验显示了类似的结果。Cu-OCNP/Lap处理的细胞在常氧条件下的细胞死亡率高于缺氧条件下的细胞死亡率，近红外辐射进一步提高了细胞死亡率( Cu-OCNP/Lap，缺氧;Cu-OCNP/Lap, Cu-OCNP /Lap (NIR-II)，常氧)。虽然增强了细胞内H2O2的补充，但游离β-Lap对细胞活力的影响有限(76±2.3%)(第7栏)，仅通过细胞内H2O2积累降低细胞死亡率(游离β-Lap，常氧状态)。非NIH 3t3细胞与不同浓度的孵化Cu-OCNP /Lap都没有和1064 nm的光,显示93%以上的细胞生存能力没有1064 nm的光和84%的细胞生存能力在1064 nm光,分别。此外，Cu-OCNP/Lap的溶血效应较低，即使在1000μg/mL浓度下，其溶血率也仅为1.9%，表明Cu-OCNP/Lap具有良好的生物相容性。
为保证Cu-OCNP/Lap的体内应用，在健康BALB/c裸鼠上通过静脉注射Cu-OCNP/Lap进行Cu-OCNP/Lap的体内生物安全性研究。Cu-OCNP/Lap处理的小鼠与PBS处理的小鼠在肝功能表征方面的ALT、ALP、AST、γ-GT参数以及肾功能表征方面的CREA和尿素参数均无显著差异。此外，Cu-OCNP/Lap治疗小鼠16天后，所有血液参数(WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、PLT)均在正常范围内，说明Cu-OCNP /Lap具有良好的血液相容性。此外，通过测定不同时间点血液中Cu2+/Cu+浓度，系统研究了Cu-OCNP/Lap的药代动力学。采用双室模型计算Cu-OCNP/Lap的血液循环半时间为2.48 h，这为Cu-OCNP/Lap在肿瘤内的有效积累提供了足够的时间。此外，通过ICP-MS测定肿瘤部位和主要器官的Cu2+/Cu+含量，研究了Cu-OCNP/Lap的生物分布。注射10 h后，Cu-OCNP/Lap在肿瘤部位积累最多。它也在肝脏和脾脏积聚。Cu-OCNP /Lap在给药24 h和48 h后，由于纳米颗粒的降解，Cu-OCNP/Lap在器官和肿瘤组织中的积累减少。小鼠体内荧光成像和PA成像的时间依赖性显示，cy5标记的Cu-OCNP/Lap在静脉注射后10小时具有最强的荧光和PA强度的积累趋势相似。Cu-OCNP/Lap经GSH降解，主要由胆汁排入粪便，肾脏排入尿液，通过测定给药后不同时间点粪便和尿液中Cu2+/Cu+含量，观察其长期毒性。Cu-OCNP/Lap随时间逐渐减少，第6天放电率达到82%左右，表明Cu-OCNP/Lap具有良好的生物安全性。
用荷瘤裸鼠观察Cu-OCNP/Lap的体内治疗效果。分别在静脉注射Cu-OCNP/Lap和Cu-OCNP 10 h后，用1064 nm激光照射肿瘤生长部位不同时间，照射6 min后，肿瘤温度达到52℃和53℃，而注射PBS小鼠的温度仅为38℃。有效的局部升温加速了血流，提示肿瘤部位氧含量水平，克服肿瘤缺氧状态。光声(PA)成像显示显著增加血红蛋白血红蛋白氧饱和度(二氧化硫)在肿瘤部位从11 PBS治疗±2.4%和10 Cu-OCNP/Lap治疗小鼠92±2.3%±3.1% Cu-OCNP/Lap治疗小鼠NIR-II辐照,表明肿瘤的有效减轻缺氧状态。肿瘤切片也显示，在1064nm光照射下，Cu-OCNP/Lap处理的小鼠缺氧诱导因子(HIF)-1α下调，H2O2大量积累。细胞内丰富的H2O2供应增强了β-Lap循环反应，增强了CDT，在1064nm光照射下，Cu-OCNP/Lap组小鼠肿瘤生长受到显著抑制。H&E图像也显示肿瘤细胞坏死最大，TUNEL图像显示1064 nm光照射下Cu-OCNP/Lap处理的小鼠细胞凋亡水平最高。而只有NIR-II照射组对肿瘤生长几乎没有抑制作用。在治疗过程中，不同小鼠组的小鼠体重保持在相似水平，正常器官未见明显的病理异常。这些结果表明Cu-OCNP/Lap具有良好的生物相容性和治疗特异性。
结论
总之，作者开发了一种负载细胞内循环反应触发β-Lap (Cu-OCNP/Lap)的自组装金属有机配位纳米粒子，在充足的H2O2供应下增强CDT。它在近红外光照射下表现出良好的光热特性，通过加速血流量提高肿瘤部位的氧含量。Cu-OCNP/Lap对细胞内GSH的响应随着Cu+和β-Lap的释放而被分解。肿瘤部位氧供应增加，β-Lap循环反应增强，细胞内丰富的H2O2增强CDT。同时，GSH的表达也被消除，从而减轻肿瘤的抗氧化防御，进一步增强CDT。细胞和体内实验结果均显示了良好的治疗效果。作者相信设计的策略将为提高CDT效率和有利于肿瘤治疗提供新的见解。
参考文献
NIR-II reinforced intracellular cyclic reaction to enhance chemodynamic therapy with abundant H2O2 supply. Yuling He, Shuwen Guo , Yue Zhang , Ying Liu*, Huangxian Ju. Biomaterials 275 (2021) 120962.https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120962
