内容提要
第二个近红外（NIR-II）窗口中的深层组织成像在广泛的基础研究中具有巨大的前景。然而，由于组织吸收和散射导致的信号衰减不均匀，阻碍了其在体内精确生物传感中的应用。在这里，使用肿瘤微环境（过氧亚硝酸盐，ONOO-）在NIR-II区域进行基于寿命的原位肝细胞癌（HCC）检测)——响应性稀土-菁Förster共振能量转移（FRET）纳米传感器。响应性NIR-II染料MY-1057作为FRET受体。稳健的寿命传感被证明与组织穿透深度无关。由于恢复期长，肿瘤病变可与正常组织准确区分。磁共振成像和肝脏解剖结果表明，在单个和多个HCC模型中，基于寿命的检测是可靠的。此外，ONOO-数量根据标准曲线计算出。
为了实现体内成像的高发光强度和稳定寿命，以镧系纳米颗粒（DSNP）β-NaYF4@NaYF4：1%Nd合成为NIR-II FRET供体，发射波长为1060 nm。用6-氨基己酸和聚（乙二醇）（COOH-PEG5000-OCH3和COOH-PEG5000-Mal，9:1）进一步修饰核壳纳米结构，以增强生物相容性，并通过疏水相互作用促进RNS响应染料MY-1057并入颗粒中。在MY-1057封装之后，DSNP@MY-1057的发光寿命从305±3µs缩短至203±2µs，FRET效率为33%。此外，将活性靶向抗体glypican-3（GPC-3）与DSNP@MY-1057结合，以增强对HCC病变的靶向能力，最终形成DSNP@MY-1057-GPC-3纳米传感器，流体动力学直径52.4 nm。
首次体外RNS反应能力DSNP@MY1057-对GPC-3纳米传感器进行了评估。在ONOO-处理后，由于结构退化，MY-1057在1057 nm处的吸收逐渐减少，导致发光强度恢复DSNP@MY-1057-GPC-3，以及纳米传感器从203±2 µs到298±2µs的寿命恢复。在808nm激发下，样品的寿命明显恢复DSNP@MY-1057-GPC-3仅在ONOO-存在的情况下观察到, 甚至其他辐射的浓度（ClO−, H2O2，O2−）比ONOO-高五倍, 说明了ONOO-的高选择性检测。
为了获得最佳能量受体，设计了一系列具有不同端基的染料（表示为MY染料）。作者的染料是通过烷基化反应和Vilsmeier–Haack反应从市售苯并吡咯衍生物合成的。MY染料的吸收峰位于1000 nm以外，并与DSNP的发射波长重叠。然而，只有MY-1058和MY-1057成功封装到DSNPs表面的PEG层中，导致寿命分别从305±3 µs明显降低到75±1和203 µs±2 µs。为了研究MY染料的包封能力，测量了COOH-PEG5000-OCH3和MY染料的分配系数（Log P，疏水性的度量）。接下来，通过测量纳米传感器的生物稳定性来评估其在体内的应用潜力。加入新鲜血液后，寿命延长DSNP@MY-1057人保持稳定，而DSNP@MY-1058立即从75±1 µs变为260±2 µs，这是由于血液对MY-1058的强烈提取作用。等温滴定量热法用于测量MY-1058与几种血液蛋白质（包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白和牛纤维蛋白原）之间的结合能力。MY-1058倾向于与牛纤维蛋白原结合，结合参数为18 140 L mol−1，进一步证明可以在血液存在的情况下从纳米传感器中提取MY-1058分子，以诱导寿命恢复。此外，还进一步研究了DSNP@MY-1057-GPC-3在各种物理介质中的发光寿命稳定性，包括全血、10%胎牛血清、细胞培养（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））和pH为6的去离子水。在48小时内观察到几乎不变的寿命值变化。因此，由于优越的寿命调节范围和良好的生物稳定性，DSNP@MY-1057-GPC-3被用作以下寿命成像实验的最佳纳米传感器。
为了研究DSNP@MY1057基于传感、强度和寿命的图像DSNP@MY- GPC-3寿命的可靠性，通过时间分辨NIR-II成像系统，在不同穿透深度下对1057-GPC-3进行了研究。在与ONOO−反应之前, DSNP@MY-1057-GPC-3填充在模型组织（1%脂内）和生物组织下的毛细血管中，基于强度的成像显示信号衰减，而基于寿命的成像显示穿透模型组织和生物组织后的寿命值。
在ONOO−前,基于NIR-II强度的成像显示深部组织穿透，DSNP@MY-1057-GPC-3信号强度随着ONOO−的增加而线性升高。然而，在0、2和5 mm的穿透深度下，强度的斜率函数分别为900、432和60 μm−1，说明了ONOO−的定量检测由于不均匀散射和吸收导致信号衰减，使用基于强度的成像不可靠。相比之下，无论穿透深度如何，都能获得一致的寿命响应。根据寿命光谱结果，随着ONOO−的加入，寿命从202±13到303±10µs连续恢复。更重要的是，在不同穿透深度的模型组织下，寿命值与ONOO−呈线性对应。ONOO−的寿命稳定斜率值−这些功能确保了基于ONOO−的生物组织下检测的寿命可靠性和ONOO−可根据标准曲线计算未知穿透深度下的数量。此外，为了研究基于寿命成像的分辨能力，DSNP@MY-1057-GPC-3纳米传感器在ONOO−反应前后在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）薄膜中封装，以制备短寿命背景和长寿命目标。对于基于寿命的成像，寿命为215±9 µs和224±9 µs的长寿命目标很容易与短寿命背景（204±10 µs）区分开来，这说明了基于寿命的成像用于体内肿瘤检测的能力。在体内成像之前，研究了DSNP@MY-1057-GPC-3在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人肝细胞癌HepG-2细胞中进行了评估，在与500µg mL孵育后显示出95%以上的存活率，表明DSNP@MY-1057-GPC-3的药物毒性较低，可适用于HUVEC和HepG-2细胞。
稳定可靠的发光寿命鼓励作者进一步探索其原位检测HCC病变的潜力。为了建立肝癌模型，将人肝癌HepG-2细胞注射到裸鼠的肝组织中以模拟自然发生的肿瘤。然后，小鼠接受DSNP@MY-1057-GPC-3纳米传感器（15 mg kg−1）静脉注射。由于网状内皮系统的捕获，这个≈50 nm流体动力学直径导致纳米传感器在肝脏有效累积，其稳定寿命约为205 µs。NIR-II发光强度成像几乎无法观察到肿瘤病变，而基于寿命的成像很容易将寿命为212±7 µs到275±49 µs的肿瘤病变与正常肝组织背景（205±7 µs）区分开来。从终身成像获得的肿瘤大小和位置与MRI和解剖肝脏白光结果显示出极好的一致性，表明终身成像的准确性和可靠性。此外，为了量化ONOO-在肿瘤病灶处的数量，通过电感耦合等离子体光发射光谱法测量肿瘤中的纳米传感器累积，以及根据支持信息中的方程式（S1）计算ONOO-，肿瘤病灶随肿瘤体积的增加而增加。最后，建立了具有多个病变的HCC模型，三个肿瘤病变的生存期为215±27 µs到249±43 µs，与正常肝组织的生存期为204±10 µs进行了准确区分。此外，多病灶HCC的寿命成像结果与MRI结果和白光照片非常一致，进一步证明了基于寿命的检测的可靠性。苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，术后24小时对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等器官的损害可以忽略不计。
结论
总之，基于NIR-II寿命的ONOO-响应性纳米传感器是使用镧系元素-菁FRET系统建立的。在HCC荷瘤小鼠中给药后，由于对ONOO-的恢复期反应，通过终身成像可以在肿瘤微环境中准确区分单个或多个病变与正常肝组织。此外，根据体外标准曲线可以定量测量肿瘤病灶处ONOO-的数量。寿命成像采用脉冲激发和延迟检测，通过去除自体荧光背景，有助于提高灵敏度和对比度。与普通强度成像相比，热积累和组织损伤的风险也降低了，因此高功率激光的使用不那么令人担忧。鉴于寿命测量不受环境光的恒定背景影响，增强现实技术可以集成在一起，以实现广泛的临床前和临床生物医学应用。
参考文献
A Tumor-Microenvironment-Responsive Lanthanide–Cyanine FRET Sensor for NIR-II Luminescence-Lifetime In Situ Imaging of Hepatocellular Carcinoma. Mengyao Zhao, Benhao Li, Yifan Wu, Haisheng He, Xinyan Zhu, Hongxin Zhang,Chaoran Dou, Lishuai Feng, Yong Fan, and Fan Zhang*.Adv. Mater. 2020, 2001172. https://doi.org/10.1002/adma.202001172.
