内容提要
近红外(NIR)区域的荧光探针有可能在生物体内提供依赖刺激的信息。在这里，作者描述了一种基于最广泛使用的近红外发色团七甲基菁支架的新型荧光探针。这些化合物是由乙酰氨基甲酸酯连接物修饰的。由于近红外发射的双重要求：氨基甲酸酯通过1，6 -消去和发色团质子化裂解，生成的氰基氨基甲酸酯( CyBams )表现出异常的ON转折比。为了说明它们在复杂体内环境中的效用，作者将一种γ-谷氨酸取代的CyBam应用于卵巢癌转移模型中γ-谷氨酰转肽酶( GGT )活性的成像。总的来说，CyBam有很大的潜力将荧光策略扩展到完整组织和活体动物成像应用。
在这里，作者报道了一系列可被一系列刺激激活的荧光菁氨基甲酸酯(CyBam)的合成、验证和应用。作者证明了磺化的七甲基甲氰胺可以与一系列可切割的氨基甲酸苄酯衍生，从而提供稳定的CyBam探针(λabs = 430 nm)。然后，这些分子经过高效触发的1,6-消除，提供了pHr响应(质子化形成λabs = 755 nm)的七甲基甲氰。与现有的远红色荧光探针不同，阳离子发色团只通过氨基甲酸酯裂解和氮质子化形成，导致一个特殊的开启比(>150×)。γ-谷氨酰转肽酶(GGT)可以在体外和卵巢癌转移模型中高度选择性地激活谷氨酸取代CyBam。总之，这些研究提供了一类新的多功能近红外荧光探针，具有极大的潜力将开启策略扩展到体内应用。
为了测试这一方法，作者首先制备了一种二磺酸化的七甲基去甲氰，NorCy7，这是achilefu之前报道过的一种化合物的脱羧形式。与之前的报道一致，这种染料在生物相关条件下呈现出两种形式，一种是非质子化淬灭形式NorCy7 (λabs= 520 nm @ pH 7.4)，另一种是质子化荧光形式NorCy7-[H+] (λabs= 755 nm @ pH 4.5)，pKa为5.2。在考察了几种条件后，作者很高兴地发现，NorCy7和4-硝基苯碳酸酯暴露于DMF中的NaH或Cs2CO3，可以产生相应的氨基甲酸酯产物。利用该方法，作者以NorCy7和1为原料，以合理的产率制备了CyBam-N3,然后用反相色谱纯化。
为了研究CyBam在细胞和体内成像中的应用，作者使用了一种经过验证的具有显著翻译潜能的荧光触发器。GGT是一种细胞表面结合酶，参与维持细胞谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸稳态。此外，它已被用作几种恶性肿瘤(包括肝、宫颈和卵巢)的生物标志物，且GGT过表达与转移相关。将关键可切割谷氨酸安装在CyBam-γ-Glu上，使用与上述类似的程序。在确认CyBam-γ-Glu的稳定性后，作者对探针进行了酶促分析。作者观察到荧光信号与GGT相关，其Michaelis常数(KM = 16 μM)与其他GGT探针得到的结果相似,作者还证实CyBam-γ-Glu是被GGT特异性激活的，当与具有代表性的蛋白酶和酯酶孵育时，不显示任何显著的信号。最后，作者使用已建立的GGT抑制剂测定CyBam-γ-Glu的选择性。作者观察到DON和GGsTop存在时荧光信号分别下降了60%和80%，证实了探针的选择性。
然后作者检测了CyBam-γ-Glu，以及相应的不可切割变体CyBam- N.C。，在细胞分析和体内成像实验。作者使用了一个先前被证明过表达GGT.40的卵巢癌细胞系SHIN-3，作者首先确定CyBam-γ-Glu具有最小的毒性。作者还发现，在SHIN-3细胞中，NorCy7表现出显著的细胞摄取。大部分荧光信号在溶酶体中观察到，其中酸性微环境可能是NorCy7-[H+]形成的原因,接下来，作者评估了CyBam-γ-Glu在与GGT抑制剂孵育和不孵育情况下的细胞活化和选择性。通过共聚焦显微镜和流式细胞术，作者观察到CyBam-γ-Glu处理的细胞有强烈的荧光信号。相比之下，在CyBam-N.C处理的细胞中观察到微弱的荧光信号。或与GGT抑制剂预孵育。受这些结果的鼓舞，作者在卵巢癌转移性肿瘤模型中测试了CyBam-γ-Glu。该模型需要腹腔注射SHIN-3-ZsGreen细胞，导致大网膜形成显著的原发肿瘤和局部播散性转移小鼠腹腔注射CyBam-γ- Glu (30 nmol)，分别于1、3和6 h后安乐死，并对原发肿瘤和局部转移进行成像。CyBam-γ-Glu与ZsGreen信号之间的良好共定位表明，探针被肿瘤细胞选择性地激活和吸收，在所有三个时间点都有显著的信号。作者还证实，这些探针可以使用传统的体内成像系统(IVIS)在活小鼠中使用。为此，作者比较了CyBam-γ- Glu和CyBam- N.C。MDA-MB-468异种移植，这是一个三阴性的乳腺癌细胞系，具有适度的GGT表达。CyBam-γ-Glu在两种药物在肿瘤和肝脏信号以及肿瘤背景比上的显著差异很容易被可视化。
最后，为了验证这一方法的通用性，作者制备并初步表征了CyBam探针的实用性，该探针可以可视化常见的活性氧(ROS)，具有验证良好的活性氧响应触发器:硼酸(H2O2)和氧化膦(O2−)。作者检测了阿霉素对前列腺癌细胞PC-3细胞ROS的诱导作用。值得注意的是，阿霉素在可见光区吸收(λmax= 480 nm)，这可能会阻碍传统可见光吸收荧光探针的使用。与预期的一样，作者观察到了超氧化物和过氧化氢的生成，而阿霉素的加入没有干扰。这些结果表明，这些探针可能在探索活性氧生物学方面有重要的用途。
结论
荧光探针是一种强大的工具，具有潜在的无创监测酶的过程和其他刺激，实时在生物体内。在这里，作者报道了CyBam，这是第一个基于七甲基菁支架的酶或分析响应型荧光探针。这些容易溶于水的探针是用可切割的氨基甲酸酯连接子修饰去甲氰支架的结果，该连接子通过1,6消除和发色团质子化被激活。这种组合导致的开启比大大超过了现有的远红色荧光探针，特别是在酸性条件下。上述结果表明，CyBam作为活体成像的可激活探针具有巨大的潜力。作者推测它们的应用可能包括光学引导的外科手术，并注意到用于七甲基花菁的广泛的光学仪器使这一前景更加诱人。随着CyBam在溶酶体中质子化后更容易发射，改善其溶酶体靶向性的努力可能会增加其信号强度。此外，由于花菁荧光团历来是最有用的生物偶联探针，作者预计CyBam与主动靶向结合后的效用可能会增强。在这种情况下，可靶向的CyBam创造了只报告特定细胞类型或感兴趣位置的酶活性的可能性。为实现这些目标所作的努力正在进行中，并将在适当时候报告。
参考文献
Norcyanine-Carbamates Are Versatile Near-Infrared Fluorogenic Probes. Syed Muhammad Usama, Fuyuki Inagaki, Hisataka Kobayashi, et al. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 5674−5679 .https://doi.org/10.1021/jacs.1c02112
