内容提要
铁死亡是一种新发现的调节细胞死亡的形式，正在成为一种很有前途的肿瘤治疗方法。然而，细胞内Fenton化学调控肿瘤铁死亡的时空控制仍然具有挑战性。在这里，作者报道了一种基于恶嗪的可激活分子组件(PTO-Biotin NPS)，它能够通过近红外光以良好的时空分辨率触发溶酶体功能障碍介导的Fenton途径来诱发铁死亡。在该系统中，设计了一种pH响应型近红外光热恶嗪分子，并通过肿瘤靶向亲水性生物素-聚乙二醇链进行官能化，以在单分子框架内设计出定义良好的纳米结构组装。PTO-Biotin NPS通过在酸性微环境中增强的光热活性，对溶酶体在肿瘤细胞内的聚集具有选择性取向。在近红外光激活后，PTO-Biotin NPS促进溶酶体功能障碍，诱导胞浆酸化和自噬功能受损，更重要的是，通过PTO-Biotin NPS光激活介导的溶酶体功能障碍显著增强细胞Fenton反应和引起铁死亡，从而提高抗肿瘤效果和减轻全身副作用。总之，作者的研究表明，pH响应型光热恶嗪组装的分子工程方法能够对固有的铁死亡机制进行时空调制，为开发抗肿瘤治疗中的无金属Fenton诱导剂提供了一种新的策略。
结果与讨论
分子设计与合成。恶嗪衍生物是一类用途广泛的染料，具有良好的化学/光稳定性和生物相容性，被选择来进化时空可控的光热剂。然而，先前报道的恶嗪衍生物(λab<700 nm)在体内的应用仍然有限，因为它们在短波长下的组织渗透深度有限。一个有效的策略是增加π共轭体系和引入额外的电子给体。因此，选择10-甲基-10H-吩噻嗪(PT)，一个共轭富电子体系，通过简单的一步脱水缩合合成恶嗪染料PTOC2，并用高分辨质谱学和核磁共振技术在辅助信息中进行了表征。
如图所示，PTOC2具有最长的吸收波长(λab=705 nm)，摩尔吸收系数值(ε)为30600 M−1cm−1，其最大发射波长位于840 nm处，荧光量子产率较低(ψ=0.2%)。最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)电子的计算表明，与3，7-二(二乙氨基)吩恶嗪(OX1)相比，PtOC2具有更大的π共轭体系和更明显的不对称振动特性，从而使吸收/发射波长显著红移(Δλab/Δλem=50/163 nm)和较大的Stokes位移(113 nm)。根据Jablonski图，抑制辐射转变途径可能更有利于产生热，这一点得到了PtOC2的光热性质和光声成像比Ox-1更大的改善的很好的证实。事实上，在808 nm激光(1.20W/cm2)的照射下，PTOC2溶液的温度从26.8℃急剧上升到54.3℃，显示出更高的光热转换效率(44.8%)，高于吲哚青绿(ICG，常见的近红外光热)(5.25%)。然而，使用1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为活性氧物种(ROS)指示剂时，没有观察到PTOC2的光动力学性质。值得注意的是，PTOC2的温升分布与其浓度和激光功率密度呈正相关。此外，还证实了PTOC2良好的热稳定性、光稳定性、溶解性和pH无关性。以上结果表明，PTOC2具有良好的光热效应，可作为一种潜在的近红外时空可控试剂。
为了将pH响应性引入到作者的光热恶嗪支架中，作者以10H-吩噻嗪为供体构建了一种酸激活的光热剂(PTO2)。正如预期的那样，在中性溶液(pH 7.4)中，由于中性分子的分子内电荷转移性能比PTOC2弱，因此PTO2的最大吸收峰位于615 nm处，如HOMO/LUMO轨道所示。然而，在酸性溶液(pH 4.0，PtO2-H+)中，PtO2的吸收峰红移到750 nm，明显长于PtOC2的吸收峰(λab=70 5 nm)。同时，它在808 nm处的保留吸收峰(71%)明显大于PTOC2的保留吸收峰(32%)，这有利于长波长近红外808 nm激光的光热激活。计算表明，PtO2-H+中两个芳香族平面之间的二面角较小(θa=−17.86°)，这是由于氢原子的空间位阻效应比甲基小。另一方面，PtO2-H+中HOMO−LUMO的能隙(1.95 eV)小于PtOC2中的能隙(2.02 eV)，这意味着PtO2-H+的波长红移显著。对PtO2在酸性环境中的10H-吩噻嗪基团的去质子化反应(PtO2-H+)也进行了结构表征，并通过1H核磁共振分析进行了验证。此外，作者还发现，与PTOC2相比，PTO2对生物亲核试剂具有更好的化学稳定性，表明其在体内应用中具有良好的实用性。
肿瘤靶向pH响应性组装体的设计、合成和光学性质。值得注意的是，作者发现吩噻嗪-恶嗪的苯胺氮上不同的烷基取代基(甲基、丙基和戊基)并不影响其pKa值(5.4−5.5)，这不仅确保了溶酶体微环境中的酸活化(4.0−5.5)，而且与已知的溶酶体促进剂氯喹(PKA8.4)相比，还减少了溶酶体的碱化。为此，作者进一步设计了聚乙二醇链与苯胺氮的共价连接，以改善其在水中的溶解性，增强靶向性。如图所示，设计和合成了带有肿瘤靶向生物素基团(在各种肿瘤细胞中过表达的受体分子)的PTO-Biotin，而没有肿瘤靶向的PTO-PEG2K作为对照。不出所料，经聚乙二醇改性后，其水溶性显著提高。重要的是，聚乙二醇化不影响PTO-PEG2K和PTO-生物素的pH敏感性(PTOBiotin在pH=4.0−7.0时表现出比率吸收响应(Ab 755 nm/Ab 630 nm)和明显的近红外荧光(PKA值分别为5.65和6.40)。此外，作者还发现，只有在酸性、中性、碱性或多个酸−碱循环中，PTO-生物素才能被pH可逆地激活，并具有良好的化学稳定性。随后，在不同的pH条件下验证了比值光声成像(PA755/PA680)和PTO-Biotin的近红外荧光成像，显示了体内成像的巨大潜力。此外，在808 nm处光照后，PTO-生物素溶液的温度随着pH的降低而逐渐升高，在pH为5.0时的光热转换效率约为45.5%，表明其具有良好的酸活化光热性能。此外，动态激光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)证实，两亲性PTO-Biotin和PTO-PEG2K可以在水溶液中形成稳定的纳米结构组装(PTO-Biotin NPS和PTOPEG2K NPS)。由于增强的渗透性和滞留(EPR)效应，这些组件有助于被动靶向肿瘤区域。此外，PTO-Biotin NPS还表现出很高的化学稳定性和长期稳定性。总的来说，人们认为PTO-Biotin NPS既具有生物素的主动靶向，又具有EPR效应的被动靶向，以及pH响应性，使其成为一种有前途的肿瘤治疗剂。
PTO-生物素NPS的体外抗肿瘤活性。为了探讨PTO-Biotin NPS对肿瘤细胞的作用，首先用流式细胞仪和荧光共聚焦成像技术检测了PTO-Biotin NPS对肿瘤细胞(宫颈HeLa、乳腺4T1)和正常肝细胞(HL-7702)的摄取能力。结果发现，HeLa和4T1细胞(生物素受体阳性)的荧光强度明显强于HL-7702(L02)细胞(生物素受体阴性)，且游离生物素可显著抑制其荧光强度。在其他人类肿瘤细胞(肺癌A549细胞、前列腺癌DU145细胞、肝癌HepG-2细胞)和正常细胞(胚胎肾HEK-293细胞、人肾皮质近端小管上皮细胞HK-2)中也发现了相同的结果。这些结果表明，生物素配体的修饰可以提高PTO-生物素NPS对肿瘤细胞的选择性。此外，作者还发现，与非生物素化的对照化合物PTO-PEG2K NPS相比，PTO-Biotin NPS可以加速肿瘤细胞的进入，这表明生物素化在通过表面过表达的生物素受体增强肿瘤细胞的摄取方面起着关键作用。
采用标准的四甲基偶氮唑蓝((3(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium)比色法测定其对多种肿瘤细胞和正常细胞株的细胞毒作用。即使在20μM的黑暗条件下，PTO-Biotin NPS对所有受试细胞株的细胞毒性也可以忽略不计，这表明PTO-Biotin NPS对正常组织的副作用很小。正如预期的那样，在近红外光照射下，PTO-Biotin NPS对癌细胞株的细胞毒性显著增加，钙黄绿素-AM和碘化丙啶(PI)染料对活细胞和死亡细胞的染色也证明了这一点。为了探讨近红外光照射下细胞死亡的可能机制，在不同细胞死亡途径的抑制剂存在下评估了HeLa细胞的活力，包括铁死亡、细胞凋亡、自噬和坏死。在加入z-VAD-fmk(一种特定的凋亡抑制物)或Necrostatin-1(NEC-1，一种坏死抑制物)后，细胞的存活率保持不变，表明细胞是非凋亡性和非坏死性的细胞死亡。Western blotting结果显示，在近红外光照射下与PTO-Biotin NPS孵育的细胞中，它们的代表性生物标志物(如组织蛋白酶D和caspase-3保持不变，进一步证明了一种不同于细胞凋亡和坏死的新的细胞死亡模式。相反，只有铁死亡抑制剂(去铁胺和Fer-1)诱导的细胞存活率(≈62/67%)显著高于不加抑制剂的处理(细胞存活率为≈44%)，这意味着近红外光激活的PTO-生物素NPS可能诱导了铁死亡。自噬抑制物(3-甲基腺嘌呤，3-MA)也被发现在提高细胞存活率方面起到了部分作用(≈为54%)，这表明溶酶体内的自噬可能参与了这种死亡模式。
近红外光激活时PTO-生物素NPS引起的溶酶体功能障碍。为了进一步验证溶酶体参与PTO-Biotin NPS在近红外光激活下介导的细胞死亡，首先研究了PTO-Biotin NPS在HeLa和4T1细胞中的亚细胞分布。共聚焦成像结果显示，PTO-Biotin NPS具有良好的溶酶体定位能力(P=0.85)，这可能是由于其质子化和包埋机制类似于溶酶体亲和性化合物54和纳米颗粒的内吞作用。不同的堆叠扫描和与其他细胞器追踪器的三维成像也证实了这一发现。即使在很长一段时间内，PTO-Biotin NPS仍能保持良好的溶酶体定位，这可能是由于PTO-Biotin NPS的溶酶体质子化的酸性，导致其滞留在溶酶体中。相反，对照化合物PTOC2由于其固有的阳离子亲脂性，主要定位于线粒体(P=0.79)而不是溶酶体(P=0.45)。
为了确定PTO-Biotin NPS治疗后溶酶体是否在细胞内正常工作，用吖啶橙(AO)作为指示剂评估溶酶体的完整性。PTO-Biotin NPS组观察到大量的来自AO的红色荧光，与其他组(对照组或PTOC2)相比没有显著差异。这一发现表明，PTO-Biotin NPS的PKA(5.65)不足以影响溶酶体膜的完整性，这可能是其低暗毒性的原因。与之形成鲜明对比的是，经808 nm光照射后，经PTO-Biotin NPS孵育的细胞AO的红色荧光完全消失，而对照组(对照组+808，PTOC2+808)仍保留着来自AO的红色荧光。这一发现表明，在近红外光照射下，溶酶体靶向的PTO-生物素NPS通过其光热激活在细胞内诱导LMP。
LMP是溶酶体功能障碍的首要标志之一，一旦发生LMP，就会释放质子进入细胞质，引发细胞内酸化，这对细胞是有害的。为了确定具有近红外光激活的PTO-Biotin NPS是否会影响细胞内的酸性，作者用一种商用pH指示剂(BCECF-AM)测量了癌细胞的细胞内pH。在近红外光照射下，仅在PTO-Biotin NPS孵育的细胞中观察到较低的绿色荧光信号，而在PTOC2或PBS孵育的细胞中未观察到较弱的绿色荧光信号。根据对不同细胞内pH值的BCEF-AM荧光定量，经近红外光照射后，经PTO-Biotin NPS处理的细胞内pH值略有下降至6.24±0.29，但在没有近红外光照射的情况下，细胞内pH值仍接近中性(7.43±0.07)。这一发现被认为是近红外光激活PTO-Biotin NPS可以通过溶酶体功能障碍引发细胞内酸化的证据。
作为溶酶体的重要功能之一，自噬会导致各种细胞内底物的降解，如铁蛋白。因此，作者继续检测PTO-Biotin NPS处理后细胞内自噬途径中关键标志蛋白的表达。Western blotting显示，近红外光照射后，PTO-Biotin NPS孵育的细胞内Lc3-II蛋白(自噬的关键标志蛋白)的表达上调，提示自噬小体的积累。此外，在PTO-Biotin NPS孵育的细胞进行近红外线照射时，作者还发现自噬通量受损的关键标志p62蛋白的过度表达，导致自噬严重受损。这一发现与自噬抑制剂可以影响PTO-Biotin NPS的光毒性这一事实是一致的。因此，这些数据证实了PTO-Biotin NPS的近红外辐射可以触发自噬小体的积累并损害自噬，为溶酶体功能障碍提供了进一步的证据。
PTO-生物素NPS在近红外光激活下通过内源性Fenton化学诱导铁死亡。为了进一步测试由PTO-生物素NP的近红外光激活所触发的溶酶体功能障碍是否与铁性下垂的发生有关，还进行了进一步的研究来研究铁性下垂的特征。细胞内ROS的积累和脂质过氧化(LPO)被认为是铁性下垂的重要标志。因此，作者使用成熟的细胞内ROS探针(2‘，7’-二氯二乙酸酯荧光素，DCFH-DA)检测细胞内ROS水平。成像结果显示，在近红外光照射下，经PTO Biotin NPS处理的HeLa细胞比对照细胞或经N-乙酰半胱氨酸(NAC，一种常见的ROS抑制剂)处理的细胞的绿色荧光增强，这为提高ROS水平提供了强有力的证据。这一发现也得到了流式细胞仪分析的证实。
随后，使用商用的·OH指示剂(香豆素-3-羧酸，3CCA)进行共聚焦成像，以检查·OH的水平(检测机制见图)，63铁死亡的典型ROS。作者发现3-CCA在黑暗中的荧光可以忽略不计，但在近红外光照射下有明显的增强。此外，研究表明，用铁死亡抑制剂铁抑素-1(Fer-1)预处理细胞，显著降低ROS和·OH水平。相反，使用单线态氧传感器绿(SOSG)作为1O2的特异性指示剂观察到1O2的产生，表明PTO-Biotin NPS不具有细胞内光动力学特性。这些数据表明，近红外光激活PTO-Biotin NPS诱导细胞内产生·OH是通过增强Fenton反应引起铁性下垂的重要机制。同时，线粒体靶向化合物PTOC2在近红外光照射后没有发现提高·OH水平，这表明溶酶体靶向光热激活PTO-生物素NPS在提高细胞内·OH水平方面发挥了作用。此外，经近红外光照射后的PTO-Biotin NPS溶液在体外没有观察到包括·OH和1O2在内的ROS的产生。总之，这些结果表明，细胞内·OH的产生不是由PTO-Biotin NPS的近红外光直接产生的，可能是由于光热效应触发了细胞内溶酶体功能障碍，从而促进了Fenton反应，进而触发了铁死亡。
为了确定这种死亡机制，作者使用Liperflo(一种商品化的LPO分析)来研究脂质过氧化水平，这是铁中毒的重要标志。成像实验显示，PTO-Biotin NPS在808 nm的光照射下显著增强Liperflo的荧光，表明有明显的脂质过氧化积聚。另一方面，Western印迹显示，在PTO-Biotin NPS+NIR照射处理的细胞中，Gpx4另一个与铁死亡相关的关键特征的表达大幅下调，表明铁死亡中的大量脂质氧化耗尽了Gpx4。此外，细胞内丙二醛(MDA)是LPO的重要终末产物，对铁性下垂有正向调节作用，在PTOBiotin NPS+近红外辐射处理细胞时，细胞内的丙二醛增加。上述结果表明，近红外光激活的PTO-Biotin NPS可以触发LMP和随后的溶酶体功能障碍，从而进一步促进细胞内的Fenton机制引起铁死亡。
PTO-生物素核糖核酸的体内抗肿瘤活性。考虑到在体外的令人印象深刻的表现，作者利用这些组件在4T1荷瘤小鼠中进行肿瘤治疗。首先用近红外荧光和PA成像检测了PTO-Biotin NPS的肿瘤靶向性。注射PTO-Biotin NPS后，肿瘤部位的荧光信号逐渐增加，最高可达9h左右，然后逐渐减弱，这有助于确定肿瘤区域近红外光激活的最佳时间点。相反，对照化合物PTO-PEG2K NPS在肿瘤中的荧光信号几乎没有增强，并在12小时内消失，表明PTO-Biotin NPS比非生物素化的PTO-PEG2K NPS具有更好的肿瘤靶向性能。与荧光成像一致的是，PTO-Biotin NPS在肿瘤部位的PA强度(PA755和PA680)随时间显著增加，高于注射PTOPEG2K NPS的小鼠。这些结果证明了PTO-Biotin NPS具有双重肿瘤靶向(生物素的主动靶向和EPR效应的被动靶向)的优越性。因此，PTO生物素NPS适合于近红外荧光和PA成像引导治疗。此外，PTO-Biotin NPS在注射后24小时的肿瘤和主要器官的体外荧光图像进一步证实了PTO-Biotin NPS增强的肿瘤浓缩和滞留特性。
接下来，对PTO-Biotin NPS在健康小鼠中的生物安全性进行了评估，以确保体内治疗具有较低的全身毒性。静脉注射后24 h，取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和血液进行H&E染色和生化检测。与注射生理盐水的小鼠相似，注射PTO-Biotin NPS的小鼠没有明显的组织病理或生理损伤，表明试验剂量的PTO-Biotin NPS没有检测到毒性。
利用PTO-Biotin NPS的这些良好特性，研究了它们对荷4T1肿瘤的小鼠的治疗效果。作者首先通过瘤内注射(I.T.)探讨其治疗效果。注射。在808 nm光照射下，PTO-Biotin NPS(I.T.)。明显优于预注抑制剂Fer-1(I.T.)组。或PTOC2(I.T.)。提示光热和铁死亡对体内肿瘤生长的抑制有协同作用。治疗24小时后，肿瘤组织的DCFH-DA和LPO染色结果也证实了PTO-Biotin NPS的铁性下垂的特征。此外，通过静脉注射来评价其抗肿瘤作用。将小鼠随机分为4组：PBS组、PBS+激光组、PTO-Biotin NPS组和PTO-Biotin NPS组。用808 nm激光照射两组小鼠，在红外相机上进行实时热成像。PTO-Biotin NPS+激光组的肿瘤温度在10min内从33.3oC显著升高到49.4oC(ΔT=16.1oC)。而PBS+激光治疗组肿瘤温度仅升高至41℃，低于损伤阈值温度。这些结果证明了PTO-Biotin NPS在体内的高效光热性能。随后，每隔一天记录各组小鼠的形态和肿瘤体积的变化，连续16天。值得注意的是，PBS、PBS+激光和PTO-Biotin NPS组的肿瘤生长迅速，而PTO-Biotin NPS+激光组的肿瘤显著受到抑制，表明PTO-Biotin NPS的近红外光激活通过触发溶酶体功能障碍介导的铁死亡而极大地增强了抗肿瘤效果。重要的是，所有组小鼠的体重和行为差异都很小。治疗结束后，对切除的肿瘤称重、拍照，并用HE染色进行组织学评价。显然，只有PTO-Biotin NPS+激光组的肿瘤组织发生了主要的损伤，而其他组的损伤迹象可以忽略不计。免疫荧光染色显示PTO-Biotin NPS+激光治疗组肿瘤组织中LC3和P62的表达显著增加，显示溶酶体功能障碍的自噬功能受损。PTO-Biotin NPS+激光治疗组Gpx4表达显著下调，进一步证实了这种显著增强的抗肿瘤作用归因于铁死亡介导的机制。对各组小鼠的主要脏器进行HE染色，与PBS组比较无明显差异。此外，还对常见的肝和肾生物标志物进行了血液生化分析，进一步证明了PTO-Biotin NPS在肿瘤中独特的时空激活特性对小鼠的肝和肾毒性可以忽略不计。总体而言，这些发现表明，PTO-Biotin NPS可以通过光触发溶酶体功能障碍来诱发肿瘤铁死亡，从而增强局部抗肿瘤作用，并将全身毒性降至最低。
总结
综上所述，作者成功地设计了一种新型的pH响应型恶嗪组合物(PTO-Biotin NPS)，它可以通过近红外光触发的内在铁死亡机制来时空控制铁死亡的抗肿瘤治疗。在作者的方法中，PTO-Biotin NPS具有酸激活的光热特性，并通过生物素活性靶向和EPR效应增强在肿瘤中的积聚。重要的是，作者证明了这种无金属的组装提供了一种非侵入性的控制策略来促进内源性Fenton反应，通过溶酶体功能障碍引发强大的铁死亡，导致胞浆酸化和自噬受损。因此，该组装体在最小的肿瘤毒性的情况下获得了强大的抗肿瘤效果。本研究不仅为分子组装工程策略实现按需、无创、高时空精度的上睑下垂控制奠定了基础，也为未来无金属下垂诱导剂的开发提供了一条新的途径，以加强对下垂铁依赖的抗肿瘤治疗。
参考文献
Molecular Engineering of pH-Responsive NIR Oxazine Assemblies for Evoking Tumor Ferroptosis via Triggering Lysosomal Dysfunction. Wei Li, Shulu Yin, Yang Shen, Haiyan Li, Lin Yuan, and Xiao-Bing Zhang. Journal of the American Chemical Society 2023 145 (6), 3736-3747. https://doi.org/10.1021/jacs.2c13222
