内容提要
大多数NIR-II荧光染料，特别是聚甲川花菁，在水溶液中不可避免地存在自猝灭现象。这种性质严重限制了它们在高分辨率生物成像中的应用。本文通过分子探针的结构修饰和两亲性多肽的共价偶联，合成了一种NIR-II大分子探针(MPAE)，具有良好的生物相容性和可忽略的系统副作用。分子探针的立体结构和聚合物的共轭能有效地阻止堆积，因此在水溶液中表现出优异的耐猝灭性(绝对QY = 0.178%)。这一显著特征使其比临床使用的ICG具有更深的组织穿透性，在NIR-II荧光成像中肿瘤部位具有较高的对比度亮度。MPAE-NPS对乳腺肿瘤小鼠在1064 nm照射下具有良好的抗肿瘤活性，且无反弹和复发，其肿瘤部位的有效积累和光热转换效率高达40.07%。所有这些突出的性能显示了MPAE-NPS在NIR-II窗口内的纳米药物传递和成像辅助光热治疗方面的巨大前景。
结果与讨论
在这项工作中，作者通过酰胺化反应将分子探针与两亲性聚合物结合，开发了一种大分子探针(MPAE)。合成的MPAE能在水溶液中自组装成均匀的纳米颗粒(30 nm)，并具有良好的耐猝灭性能。经静脉注射后，MPAE可以在高对比度成像的肿瘤部位有效聚集，且其在1064 nm照射下的可观光热性能使其成为NIR-II窗口成像辅助光热治疗的纳米治疗剂。
在作者之前的工作中，他们以苯并[c, d]吲哚-2(1H)- 1为原料，合成了两亲性聚合物(FD1080@P(OEGMA)-P(Lys))包覆的部分亲水NIR-II探针。同时，由于FD-1080溶解性和产率较差，限制了其与大分子聚合物的偶联。将侧链取代基由磺酸盐改为乙基，提高了其在有机相中的溶解度，提高了NIR-II探针的产率。作者通过简单的四步反应合成了改性探针ET-1080，并进行了NMR和ESIMS光谱等相关表征。合成的ET-1080在有机相(DCM，甲醇，DMSO)中具有良好的溶解度，在第二近红外区域具有固体吸收(DCM中= 1.87 × 105 m−1cm−1)和荧光发射峰(abs= 1027 nm,em = 1080 nm，在808 nm激光的激发下，Φ= 0.182% DCM)。值得注意的是ET-1080在不同溶剂中的发射光谱在1200 nm附近出现肩峰。不同的溶胶在整个NIR-II区域指纹图谱复杂，特别是在1000-1300 nm (DCM在1155 nm, MeOH在1195 nm, DMSO在1175 nm)，这导致了荧光光谱的不同下降。
通过将羧基(3-哌嗪-1-丙酸)偶联到ET-1080的氯基反应位点上，合成改性染料ET-1080-COOH (ETNC)，构建负载染料的纳米颗粒，实现NIR-II激光诱导光热治疗。1H NMR的峰值为10.30 ppm,13C NMR的峰值为185 ppm，表明-COOH基团的存在。在质谱中，ETNC在m/z = 649.35 [m - i]+处有信号峰。羧基化修饰染料(ETNC)在860 nm附近有一个宽而强的吸收峰(DCM = 1.55 × 105m−1cm−1)，在1041 nm处有一个发射峰(808 nm激光激发，在DCM中Φ= 0.181%)。叔氨引起ETNC分子内电荷转移(ICT)过程，增加了改性后的分子刚度。与ET-1080相比，导致了表观吸收蓝移。这一明显的ICT过程可以有效地增加荧光染料在DCM溶剂中的Stokes位移(从54 nm到181 nm)，从而降低自猝灭效应。
在mPEG-NH2引发的基础上，采用天冬氨酸NCA开环聚合引入多肽链，以增加聚合物的两亲性和生物相容性。羰基化探针(ETNC)通过胺化反应与聚合物链末端的氨基连接。反应产物经1H NMR 和GPC检测。虽然由于ETNC含量低，CDCl3中的1H NMR信号难以准确识别ETNC的比例，但根据DCM中UV-vis-NIR吸光度测量，ETNC最终占聚合物的比例被校准为8.53%。与两亲性聚合物相比，酰胺化大分子的洗脱时间略有缩短，说明存在分子量更显著的目标大分子探针(MPAE)。
两亲性聚合物MPAE在平均粒径为30 nm (PDI = 0.241)的水溶液中自组装成纳米粒子，通过DLS测定其电负性为-0.231mV。MPAE纳米颗粒的TEM显微图显示，这些颗粒分布均匀，粒径为25 nm。
与DCM中的ETNC相比，PBS (pH 7.4)中MPAE-NPS的最大吸收峰的蓝移可以忽略不计(856 nm)，荧光发射峰约为1060 nm(由808 nm激光激发)。值得注意的是，MPAE-NPS在水溶液中的客观绝对量子产率为0.178%，与分子探针ETNC在DCM中的相对量子产率(0.181%)相同，表明MPAE-NPS在水溶液中具有良好的抗猝灭性能。此外，MPAE-NPS的吸收肩峰(1046 nm)为NIR-II光诱导光热治疗提供了潜在的应用价值。在这里，作者使用1064 nm激光(1.0 W cm−2)有两个原因。首先，MPAE-NPS在1046 nm附近的吸收使其吸收光产生热效应;更重要的是，1064 nm激光在生物组织穿透方面具有明显的优势，为缺氧肿瘤的深度提供更有效的治疗。
光热转换效率和光热稳定性是评价光热效应的重要参数。MPAE-NPS的PCE()为40.7%，远高于临床使用的吲哚菁绿(ICG)(~ 3.1%)、和他们最近报道的染料HQS-Cy(∼35%)。此外，将1.0 mL MPAE水溶液置于1064 nm激光下加热(10分钟)和冷却(15分钟)循环。温度变化如图所示。在回收过程中未发现明显的热行为退化，这表明MPA-NPs具有良好的光热稳定性，这可能得益于其大分子刚性。
在808 nm的连续辐照下，MPAE-NPS的发射光谱变化不大，相对最大FL强度保持不变。同时，MPAE-NPS在生物培养基中孵育的FL成像能力如图所示，全血孵育的MPAE-NPS和PBS(含10% FBS)在孵育5天后的荧光信号变化均可以忽略不计。这些结果表明，MPAE-NPS具有良好的荧光和生物稳定性，值得进一步研究。
由于NIR-II PTT具有较深的生物组织渗透性，其应用受到越来越多的关注。为了比较NIR-I和NIR-II窗口之间的光热效应，这里作者覆盖了含有不同厚度(0,3,5 mm)鸡胸肉MPAE-NPS溶液的塑料离心管，然后将它们暴露在808 nm或1064 nm激光下5分钟(1.0 W cm−2)。用手持式热像仪检测热曲线图和温度变化。在808 nm激光照射下，不同鸡胸肉厚度(0,3,5 mm)的MPAE溶液的最终温度分别为61.5℃、35.2℃和32.4℃，而在1064 nm激光照射下对应的温度分别为57.6℃、46.4℃和43.2℃。这一显著差异证实了即使MPAE-NPS在808 nm处具有更高的吸光度，1064激光在诱导深层生物组织光热效应方面仍具有压倒性的优势。
作者采用MTT法评价MPAE-NPS的细胞毒性。测量了辐照过程中不同浓度的T温度变化，可以发现，对照组的温度变化可以忽略不计(约5.0°C)，但实验组的温度变化显著增加(5.0 μg mL−1的15.8°C, 10.0 μg mL的17.6°C, 15.0 μg mL的20.4°C, 20.0 μg mL的24.3°C, 25.0 μg mL的28.2°C)。两种类型癌细胞(4T1和Hela)的MTT结果如图。结果表明，当浓度达到20 μg m L−1时，细胞活力急剧下降(< 20%)。15.0 μg m L−1照射组短暂热疗(小于2 min)不能完全杀死细胞，但最终温度约为50.0℃。据报道，热疗(> 48°C至少2 min)可以有效地诱导细胞坏死，但是轻度热疗(小于2 min)可抑制细胞活力，促进热休克蛋白的释放。考虑到基本环境温度(~ 30°C)，温度升高11 ℃就会影响细胞活力，而温度升高18℃(2 min以上)就能杀死细胞。同时，作者通过活/死染色评估MPAE-NPS的光热治疗能力，发现MPAE-NPS处理4T1细胞后出现严重的细胞死亡。值得一提的是，所有细胞在黑暗条件下都保持了良好的存活率，这进一步说明了MPAE-NPS具有良好的生物安全性和客观的光毒性。
首先，作者用不同的长通滤波器测量了几种荧光染料在808nm激发下的体外荧光图像。可以直观地看到小分子探针ET-1080和ETNC在DCM中的荧光图像，并且在1300 nm之后仍然保持特定的荧光信号。本研究还比较了MPAE-NPS与临床应用ICG在PBS中的荧光成像能力。可以看出，MPAE-NPS在1200 nm后仍保持较高的荧光亮度，而ICG信号在1100 nm后急剧下降，这表明MPAE-NPS荧光成像范围更大、更广。在上述结果的鼓励下，作者分析了MPAE-NPS在模拟生物组织(1%在三脂体)中的穿透能力。将填充MPAE-NPS和ICG溶液的毛细血管浸泡在脂质内，用808 nm激光激发。然后，他们在1000 nm以上的不同深度采集成像信号。随着穿透深度的增加，所有荧光团的FL强度减弱，轮廓模糊。在这里，作者测量了FL图像的信号背景比(SBR)作为深度的函数。据报道，低于阈值2时，成像剖面无法被解析在这里，可以看到MPAE-NPS成像可以区分8 mm深的毛细血管的尖锐边缘，在NIR-II范围内，这比ICG(~ 3.5 mm)深2.3倍。这些都得益于MPAE-NPS在生物组织中的高亮度和低散射。
然后测量体内NIR-II FL成像。注入MPAE-NPS和ETNC (2.5mg kg−1)后，在808 nm激光下连续获得FL图像。在图中，由于MPAE-NPS的积累，肿瘤FL信号随着时间的推移逐渐增加，并在注射后24 h达到最大T /NT为13.6。相比之下，ETNC组的肿瘤FL强度可以忽略不计，在注射后6 h达到最大T /NT为2.02，这分别表明ETNC在肿瘤部位的积累较差，这在MPAE-NPS的肿瘤成像和边界划分方面具有潜在的应用价值。注射后48h切除肿瘤及主要脏器。在图中，肝脏的FL亮度最高，说明肝脏是纳米药物的中心代谢器官。
此外，还测量了MPAE-NPS的血液循环，以探索EPR效应的时间窗口。注射后12 h，血液中仍有一定数量的MPAE-NPS存在，而在注射后24 h, MPAE-NPS急剧下降，说明注射后12 h, MPAE-NPS增强血液循环，并通过EPR效应在肿瘤部位积聚。
由于MPAE-NPS具有突出的光热性能、显著的肿瘤积累和优良的生物相容性，作者评估了其在1064 nm (1.0 W cm−2)照射下的体内抗肿瘤性能。荷瘤T小鼠随机分为3组(n = 6)，分别注射PBS、ETNC和MPAE-NPS (2.5 mg kg−1)。注射后12 h用红外摄像机记录肿瘤部位的热成像和温度。MPAE-NPS组肿瘤温度在6 min内升高23.8°C，而对照组在相同条件下仅较6.8°C (ETNC组)和4.7°C (PBS组)有微弱升高。处死部分小鼠，PTT后24h取肿瘤进行H&E染色。MPAE组(L+)细胞坏死明显，对照组细胞形态规则，可证实其抗肿瘤作用。随后，对肿瘤体积和小鼠体重进行监测。可以看出，实验组肿瘤开始结痂，并逐渐消融，在额外的时间内没有复发，而对照组肿瘤生长没有受到抑制。值得一提的是，小鼠的体重在整个治疗期间没有明显的波动。这些明显的效率对比无疑表明MPAE纳米颗粒具有良好的体内光热效应。治疗结束后，收集所有肿瘤称重拍照。主要器官H&E染色显示MPAE-NPS具有生物相容性和安全性。
为进一步探索PTT治疗过程中潜在的全身毒性，在注射MPAE-NPS (2.5mg kg−1)后的第1天、第4天和第6天(n = 5)监测小鼠的血液生化指标，同时收集主要器官进行荧光成像。肝脏各主要器官的亮度最高，但逐渐减弱，尤其是在第6天。此外，采用酶标仪检测肝脏相关谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)、肾脏相关肌酐(CRE)和血液尿素氮(BUN)、心脏相关肌酸激酶(CK)、肌酸激酶- MB、同工酶(CK- MB)等主要生物安全指标。这些参数均保持在正常范围内，尤其是对肝损伤敏感的ALT和AST，表明MPAE-NPS的肝毒性可以忽略不计。所有这些结果表明，MPAE-NPS是一种很有前途的成像辅助PTT药物，且全身毒性小。
总结
作者构建了一个两亲性多肽偶联大分子探针MPAE。它能自组装成均匀的纳米颗粒(30 nm)，具有优良的抗猝灭性和良好的水溶液稳定性，具有良好的组织穿透能力和显著的PCE(40.7%)。MPAE-NPS通过EPR效应在肿瘤部位有效聚集，在NIR-II荧光成像中具有高对比度亮度。同时，该纳米药物在1064 nm的安全功率密度(1.0 W cm−2)照射下具有良好的抗肿瘤效果，且具有良好的生物相容性，全身副作用很小。这些突出的性能加速了其作为NIR-II窗口成像辅助光热治疗的潜在应用。
参考文献
Antiquenching Macromolecular NIR-II Probes with High-Contrast Brightness for Imaging-Guided Photothermal Therapy under 1064 nm Irradiation. Quan Cheng, Youliang Tian, Huiping Dang, Changchang T eng, Kai Xie, Dalong Yin,and Lifeng Y an*. Adv.Healthcare Mater.2022,11, 2101697. https://doi.org/10.1002/adhm.202101697
