内容提要
荧光成像在第二个近红外窗口(NIR-II)允许可视化的深度解剖特征具有前所未有的清晰度。NIR-II荧光团从半导体纳米材料到有机分子染料的广泛光谱材料中提取，但不幸的是，所有41,000纳米发射的水溶性有机分子都受到低量子产率的影响，这限制了时间分辨率和穿透深度。在这里，作者报道了用磺化NIR-II有机染料(CH-4T)定制蛋白质复合物的超分子组装，产生了110倍的荧光，产生了迄今为止最高的量子产量分子荧光团。明亮的分子复合物允许在第二个近红外窗口中以最快的视频速率成像，以每秒50帧(FPS)的速度减少了b50倍的曝光时间，能够分辨小鼠的心脏周期。此外，作者还证明NIR-II分子复合物在小鼠体内深部淋巴结成像方面优于临床批准的ICG。
虽然目前大多数NIR-II荧光团由无机半导体纳米材料组成，长波长有机染料类似于那些在可见和NIR-I的功能和生物相容性的发展应该允许NIR-II成像迅速过渡到临床设置和更广泛的研究社区。给体-受体-给体(D-A-D)染料是一种很有前途的小分子荧光团，其放射量超过1000 nm。传统上用于半导体有机电子器件，如OLEDs和染料敏化太阳能电池，这种高度可调的染料结构是围绕强电子受体构建的，如苯并[1,2-c:4,5-c0]双([1,2,5]噻二唑)(BBTD)，强电子给体通过p-间距连接到苯并[1,2-c:4,5-c0]双([1,2,5]噻二唑)，以降低能隙。分子工程的最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)能级之间的能量差允许波长调谐横跨NIR-II发射峰。然而，这些染料的疏水性质需要额外的功能化来增加水溶性。作者最近报道了第一个用于NIR-II成像的有机染料，一种羧基D-A-D染料，称为CH1055，如果不与亲水蛋白结合，则需要聚乙二醇化。虽然CH1055-PEG表现出良好的药代动力学，但~0.3%的低量子产率，而典型的NIR-II荧光团，为进一步改进留下了充足的空间。
在此，作者证明了将官能团从羧基转变为磺酸基，会产生一种完全水溶性的有机NIR-II染料(CH-4T)，它很容易与血浆蛋白形成超分子组装，从而产生显著的荧光亮度增加。与磷酸缓冲溶液(PBS)相比，CH-4T的荧光强度使血清中的~50倍增加，并显示出惊人的高量子产率，高达~%。此外，在血清中简单地将染料加热到70℃，10分钟，可将其量子产量提高到11%，为临床适用的NIR-II荧光团提供迄今为止报道的最高量子产量。在注射前通过蛋白络合优化CH-4T的亮度，允许在NIR-II中使用~1.5-2 ms曝光时间和超快的每秒50帧(FPS)动态成像，能够以前所未有的时间分辨率解决心脏周期。此外，作者证明了在NIR-II中，使用CH-4T复合物(成像性能优于吲哚菁绿(ICG))，小鼠深层淋巴结(~5 – 8 mm)可以清晰成像。
磺化小分子有机染料(CH-4T, 1.4 kDa)的合成是通过在DMSO中通过O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N0,N0-六氟磷酸四甲基溴铵(HBTU), N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)偶联在羧基CH1055和牛磺酸之间形成酰胺键实现的(完整的合成细节见补充方法)。牛磺酸是一种常见的生物分子，遍布全身，含有胺和磺酸基，因此可以轻易地修饰CH1055。结合后,CH-4T通过高效液相色谱纯化，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析洗脱组分，收集到四个牛磺酸基团共轭的CH1055。核磁共振(NMR)光谱进一步证实了CH-4T的合成和纯度。紫外可见吸收光谱显示在~738 nm处有一个强峰，在去离子水(DI)、PBS和胎牛血清(FBS)中匹配808 nm(光密度(OD) 0.1)的吸光度，并在808 nm激发下在铟镓砷(InGaAs)相机上成像。CH-4T在DI水中的荧光亮度略高于PBS，但将游离的CH-4T染料与FBS (10 ms, 1100LP;为更高的图像动态范围;参见CH-4T光谱的详细方法)。相比之下，CH1055-PEG在相同的生物介质中以同等浓度混合，在所有溶液中产生均匀的NIR-II亮度。在808 nm激发下，收集到的PBS和FBS中的CH-4T和CH-PEG的荧光发射光谱(使用NIR-II分光光度计，补偿了不同波长探测器量子效率的变化显示，血清中CH-4T的荧光亮度比CH-PEG高16倍，再次表明在血清蛋白存在的情况下，CH-4T染料变得明亮。CH-4T与各种来源的FBS混合后产生的荧光增强效果几乎都是相同的，无论制造商是谁。
为了研究CH-4T与生物大分子的结合，作者将CH-PEG在PBS中的归一化荧光发射光谱与PBS和FBS中的CH-4T进行了比较。CH-PEG和CH-4T在PBS中的荧光发射峰出现在~1055 nm处，发射峰为900 ~ 1400 nm，与之前CH1055光谱测量结果一致。然而，血清中的CH-4T产生了~50 nm的低致变色位移，这表明染料和蛋白质之间通过疏水范德华氏相互作用以及磺酸基和阳离子氨基酸残基(如组氨酸、赖氨酸和精氨酸)之间的离子配对形成非共价结合。
优化CH-4T蛋白复合物的亮度。为了利用CH-4T -蛋白相互作用来开发超亮NIR-II探针，作者在CH-4T中过量添加常见血清蛋白，观察NIR-II相机下荧光增强的增加。人血清白蛋白和牛血清白蛋白(HSA和BSA)显示出强烈的荧光增强17倍，但强度比血清中的染料低 ~2X。当与IgG抗体混合时，CH-4T荧光更弱。荧光滴定通过增加HSA浓度，同时保持CH-4T在恒定的1 mM来确定近似的结合化学计量学。最大荧光强度发生在大约2:1 HSA:CH-4T摩尔比的位置。
由于CH-4T的亮度似乎高度依赖于染料和蛋白质表面之间的最佳结合，人们试图对复合物进行加热，希望将CH-4T暴露在蛋白质内部通常难以接近的疏水区域中。加热10分钟后，盛有CH-4T和FBS混合物的小瓶的亮度随温度稳定增加，直至~75-85℃。然而，加热到~85℃以上的温度导致荧光强度急剧下降。在~90℃以上温度下观察到显著的聚集，而在较低温度下，通过离心后加热(30分钟，15,000转/分)去除少量聚集。加热几乎每一个染料蛋白复合物都会导致荧光强度显著增加，从~1050到~1000 nm有类似的~50nm低致变色位移。回到室温后，与单独混合溶液相比，热稳定的染料蛋白复合物保持其增强的亮度。
CH-4T蛋白复合物代表了基于有机分子的最亮的荧光剂，其发射峰位于NIR-II的~1000 - 1100区域。用NIR-II相机比较小瓶和比色管中的荧光团的亮度可能会由于滤光片间效应而引起误差，而低致变色发射峰移与非线性相机量子效率作为波长的函数需要更严格的测量。CH-4T/FBS加热至70℃10分钟后，称为CH-4T/FBS- HT的相对荧光亮度分别是碳纳米管的28倍、36倍和22倍(QY=0.4%;IR-26=0.5%),CH-PEG (QY=0.3%;IR-26=0.5%)和IR-26 (QY=0.5%)，在波长校正的NIR-II分光光度计上测量时，CH-4T/PBS和CH-4T/FBS-HT的亮度差为110倍。由于IR-26参考荧光团(QYIR26~0.05-0.5%;CH-4T/PBS、CH-4T/FBS和CH-4T/FBS- HT的绝对量子产率分别在0.0098-0.098%、0.48-4.8%和1.8-10.8%之间。图中的NIR-II荧光图像(1000LP, 10 ms)定性地显示了荧光明亮的CH-4T蛋白复合物与当前NIR-II造影剂(如单壁碳纳米管(SWCNTs)和CH-PEG)之间的不同亮度水平，所有的吸光度在808nm (OD 0.1)匹配。
CH-4T超快速体内成像。为了研究游离CH-4T染料和亮度优化的CH-4T蛋白复合物的体内光学性质，在808nm激发下，功率密度为140 mWcm-2，以等效剂量(90 mg, 100 mL, OD 3.2, 808 nm)静脉注射游离CH-4T和CH-4T/FBS-HT后，对小鼠后肢体血管进行视频速率成像(1000LP, 35 ms曝光时间)。注射后10 min，股血管的荧光强度有明显的差异，说明在注射游离的CH-4T后，预制的CH-4T/FBS-HT复合物的量子产率高于循环血液中与体内血清蛋白复合物的CH-4T，产生更亮的造影剂。与注射游离染料的小鼠相比，CH-4T/FBS-HT注射小鼠的~2X动脉较亮，这与CH-4T/FBS-HT与血清中混合的游离染料观察到的~2 – 3X强溶液亮度差异有关。相比之下，小鼠在任何时间注射等量的CH-PEG (100ml, OD 3.2, 808 nm;)，即使在更高的暴露时间50 ms，因为CH-PEG没有显示与血清蛋白络合，在体内提供增强的荧光。虽然与游离染料相比，CH-4T/FBS-HT复合物的稳态容器荧光强度提高了~2 X但对于注射后立即成像来说，预先优化CH-4T -蛋白复合物的亮度是非常必要的。作者绘制了CH-4T和CH-4T /FBS-HT注射后的前250 s股动脉内背景减感兴趣区域(ROI区域的位置如图中红色箭头所示)的综合强度。注射后10分钟后，观察到股骨脉管系统荧光强度的明显差异，表明与CH相比，CH-4T/FBS-HT 的预制复合物的量子产率更高注射游离CH-4T后，在体内与循环血液中的血清蛋白复合的CH-4T产生更明亮的造影剂。相比之下，从注射了游离CH-4T的小鼠股动脉观察到的荧光强度逐渐增加，是因为游离染料在循环过程中需要更长的时间与血清蛋白结合，以达到其充分的荧光潜在亮度。通过将预绑定染料与游离染料的股动脉荧光强度进行分割，较早的时间点显示出高b33倍的亮度，与B200 s时的稳态亮度差b2倍相平衡。此时，注射游离CH-4T的小鼠血管强度已经形成稳定的复合物，并达到稳态最大荧光亮度。图3a,b中CH-4T的股动脉和预先调亮的复合物注射的小鼠之间的亮度差异现在与注射后较长时间点的亮度差异相匹配。与CH-4T形成强烈对比的是，同等剂量的CH-PEG注射后股动脉内荧光信号几乎检测不到增加，并保持恒定的低荧光强度。
在注射后的第一秒内，预先结合的CH-4T在血管系统中循环的亮度明显更高，可以用于血流动力学过程的高时间分辨率成像。在使用曝光时间仅为1.5-2秒，仪器开销时间为~19 ms的超快速50帧/秒视频成像过程中，在等效时间点的选定帧中，注射免费CH-4T和CH-4T/FBS-HT (250 mg CH-4T/小鼠)之间的明显差异可以清楚地看到。在注射后2 s，由于染料在体内的发光动力学缓慢，从注射了游离CH-4T的小鼠的血管中没有观察到荧光。相比之下，注射CH-4T/FBS-HT时，在50fps成像中，股动脉得到了清晰的分辨。对注射CH-4T/FBS-HT后3 s的股动脉综合ROI强度进行绘制，可以对心脏周期进行精确成像，其中与心室射血相对应的强度峰值与之前使用较低量子产率的半导体NIR-II聚合物进行的尝试相比，分辨率更高。在生成图所示图像的50帧FPS视频的前9.4秒内，从每帧中选择跨越后肢的单行像素的荧光强度，并将其绘制为时间的函数。粉色位置标记表示后肢的边缘。通过绘制单行像素随时间变化的荧光强度线轮廓图，可以清楚地看到，通过CH-4T/FBS-HT对比剂可以很容易地识别出沿股动脉的血流前沿，即图中显示的强烈红色条纹，但在图中注射未结合的CH-4T时，前B10 s内几乎看不到荧光。
CH-4T复合体的深部淋巴结显像。为了进一步探讨高亮度造影剂在生物医学荧光成像中的优势，比较了第一和第二近红外窗口对淋巴管和淋巴结的成像质量。裸鼠俯卧位对腘窝和骶淋巴结进行成像，在两个脚垫注射荧光团。ICG分散于50 mM DI水中作为NIR-I造影剂，观察到淋巴结背景比为8.6±2.9，这与报道的值一致。虽然ICG与HSA等蛋白质混合后可以形成复合物，但与游离ICG相比，预混ICG/HSA复合物在淋巴结检测效率方面的优势尚不清楚。ICG和ICG/HSA-HT的淋巴结荧光同样产生了几乎相同的强度。但是，注射后立即等效50 mm剂量后，左侧脚垫注射的游离CH-4T和右侧脚垫注射的CH-4T/HSA-HT在~8倍亮度上的差异非常明显。游离CH-4T和CH-4T/HSA-HT在腘窝和骶淋巴结的不同荧光强度表明，需要预混形成超明亮的复合物用于NIR-II淋巴显像。CH-4T/HSA-HT导致淋巴结与背景比为29±7.6，淋巴结特征明显更清晰，腘窝/骶部半宽为2.52±0.23 mm/ 1.61±0.11 mm，而NIRI中ICG组为4.86±0.17 mm/4.4±0.29 mm。
为了证明NIR-II成像增强了体内深层特征的清晰度，在拉伸腹部以减少腰椎淋巴结与小鼠表面之间的距离后，作者对腰椎淋巴结进行了可视化。仰卧位观察小鼠时，腰椎淋巴结位于脊柱两侧，降主动脉分叉的外侧，并与负责引流脚垫和腿部的淋巴通道相连。在不扭曲的情况下，腰椎淋巴结与表面之间的距离接近~1-1.5 cm，其大部分由图中的插图所示的肠道组成。拉伸腹部可提供~0.5-0.8 cm的固定成像深度，并允许两个窗口有足够的淋巴结荧光信号(详见方法)。
ICG (50 mm)注射于两侧足底和手指;随后，小鼠被物理固定并在成像平台上拉伸，直到在NIRI (300 ms, 785-900 nm)。随后，在同一只小鼠上以相同的方式注射CH-4T/HSA-HT (50 mM)，并在InGaAs探测器上成像(400 ms, 1100 þ nm)，显示腰椎淋巴结的分辨率显著提高。CH-4T蛋白造影剂成像允许B13信号背景比(SBR)的单个节点分辨率，而不是~2.5信号背景比(SBR)的NIR-I中观察到的弥漫性联合特征。增强的清晰度反映在图中两个窗口腰椎淋巴结的荧光横断面强度剖面，以及NIR-II中~5X较低的背景自发荧光水平。使用785 nm激光(16 mWcm-2)在两个窗口进行成像，为两种染料提供恒定的激发功率密度。
讨论
在第二个近红外窗口成像允许光学成像更深入地观察身体，比任何其他波长更清晰。然而，小分子有机染料的发展是这一成像技术广泛应用的必要条件。无机纳米材料对于基于荧光的临床前动物成像非常出色，虽然目前许多纳米材料NIR-II探针在临床转化方面显示出强大的前景，但有机NIR-II染料在结构和药代动力学上与FDA批准的NIR-I有机荧光团(如ICG和亚甲基蓝)相似，应该会加快NIR-II成像向临床的过渡。不具备纳米材料荧光团专业知识的研究人员将受益于有机NIR-II染料，这些染料可以被纳入目前依赖于大量可见和NIR-I染料的生物成像程序。CH-4T的完全水溶性结合其高血清量产率使其成为吸引人的NIR-II临床候选药物，能够轻松地用于生物医学血管成像程序。与之前的低量产率造影剂(如CH-PEG)相比，CH-4T可以将用于生物医学成像的荧光染料剂量大幅减少~25倍。CH-4T还可以独特地在NIR-II光谱窗口中实现最快的时间分辨率。
D-A-D NIR-II染料结构显示出通过其组成成分的分子工程开发NIR-II荧光探针阵列的强大潜力。负电荷磺酸基的添加转化为CH1055的体内量子产率的戏剧性提高，允许在NIR-II波长1的成像中以最快的帧率和最低的曝光时间进行视频速率成像。CH1055分子结构的微小变化使D-A-D染料的光学性能显著提高，而进一步优化电子受体、p-间隔体、电子给体和官能团可能进一步提高NIR-II的最大量子产率。
高量子产率NIR-II荧光团的出现使NIR-II医学成像在曝光时间、成像速度和穿透深度方面具有许多令人兴奋的可能性。碳纳米管、封装有机染料和Ag2S量子点造影剂需要100毫秒的曝光时间，甚至可能超过200毫秒的视频速率成像2 - 5。正常视频速率成像的仪器开销时间为B80毫秒，在典型的NIR-II曝光时间为100毫秒时，帧率为5.3 FPS。该给体-受体NIR-II聚合物的名义量子收率为1.4%，允许B20 ms曝光时间和25 FPS1帧率的超快视频。CH-4T能够轻松地在1.5-2毫秒的曝光时间下以50帧/秒的速度捕捉超高速视频，这实际上是他们的成像系统(52帧/秒)在超高速成像条件下仪器开销时间为19毫秒的最大可能帧率。
虽然CH-4T的亮度明显高于NIR-II聚合物，但由于仪器开销时间是目前限制帧间时间的主要因素，CH-4T的帧率仅为聚合物的两倍。然而，在CH- 4T复合物的1.5-2毫秒曝光时间下，通过硬件和软件修改设计更快的NIR-II荧光成像系统理论上可以产生超过500帧/秒的帧率。此外，这种高亮度染料还可以检测到身体更深层的特征，腰椎淋巴结的清晰分辨率就是证据。当激发功率密度下降时，深入人体，高量子产率NIR-II荧光团需要产生足够的荧光信号。虽然之前的材料，如碳纳米管或CH-PEG，由于散射最小，可以清晰地识别较浅的特征，但它们的量子子产率不足以检测较深的特征。高量子产率NIR-II染料还降低了必要的激发功率密度，这一点可以通过ICG和CH-4T/HSA-HT在16mWcm-2的等效功率密度和相似的暴露时间下对腰椎淋巴结的成像得到证明。此前，NIR-II中的碳纳米管(808 nm激发，140 mWcm-2)比NIR-I中的IR800 (785 nm激发，8 mWcm-2)需要17.5倍的功率密度来成像后肢股骨血管。
在这一点上，作者想强调IR-26绝对量子产率的可变性，IR-26是参考荧光团，是所有报道的NIR-II量子产率的基础。首次报道的IR-26在1,2-二氯乙烷(DCE)中的量子产率为0.5%，其应用价值最为广泛，但最近的报道将量子产率设置为0.05和0.1%，这一结果受到了质疑。CH-4T和配合物的量子产率是基于HiPCO SWCNTs作为参考的，其量子产率类似于IR-26。之所以选择HiPCO SWCNTs作为量子产率参考，是因为纳米管易于在水中分散，与IR-26不同，IR-26可以在相对较短的时间内降解，HiPCO SWCNTs具有优良的稳定性，是最常见的NIR-II对比剂5。NIR-II染料的亮度将被列出相对于其他NIR-II荧光团以及绝对量子产率范围从今以后，直到IR-26报告的量子产率的差异被解决。由于这项工作标志着参考绝对量子产率的转变，CH-4T的绝对量子产率为1.1-11%，IR-26=0.05-0.5%。改变基准的绝对量子产率只能对整个NIR-II场的亮度进行缩放，而不会影响NIR-II发射材料之间的相对亮度。无论如何，CH-4T是迄今为止任何NIR-I或IR-II染料中最亮的有机荧光团，发射超过1000 nm，其量子产率比HiPCO SWCNTs(一种经典的NIR-II成像探针)高27倍。
有机NIR-II染料由大型疏水p系统和血浆蛋白组成，通过调节它们之间的相互作用，可以获得发光超过1000纳米的荧光染料。与ICG的~4X在暴露于血清蛋白时亮度增加的方式类似，PBS中的CH-4T/FBS-HT和CH-4T之间110倍的荧光增加很可能是通过多个过程的结合发生。首先，CH-4T的两亲性可以通过范德华力在水溶液中形成聚集体，通过ICG29中已知的自猝灭来降低亮度。通过蛋白结合CH-4T个体化分散聚集物应该有助于血清量产率的提高。其次，CH-4T由疏水袋构成的几何约束应能促进染料的刚性构象，从而将导致非辐射衰减的扭转旋转降至最低。与自由旋转的分子相比，刚性分子具有更短的荧光寿命和更高的量子产率，因为它们通过内部转换耗散的能量更少。内转换是低能隙NIR-II染料最重要的非发射竞争过程，因此通过蛋白质结合增加硬度将有利于增加量子产率。加热放大了这些效应，因为CH-4T可能会纠缠在一个刚性构象中，因为增加的热能允许进入通常难以接近的疏水口袋。在较高的温度下，CH-4T可能会完全被包裹在疏水结构域中，因为蛋白质在加热后会重新折叠在染料周围，以减少暴露在水中的疏水侧链的数量。此外，给体-受体染料在极性环境中容易发生扭曲的分子内电荷转移(TICT)，特别是当由强电子给体和受体s38 - 41组成时。分子模拟预测CH1055的核心可能以非平面构象存在，这可能有助于形成可以抑制荧光的TICT红移构象12。观察到的~50 nm的低致变色位移可以通过CH-4T采用平面构型和p轨道对齐来解释，当通过疏水或电荷相互作用与蛋白质结合时，结合溶剂弛豫最小化。
对NIR-II有机染料与生物组织相互作用方式的基本理解，对于创建具有高SBR比率和高排泄水平的探针至关重要。CH-4T通过蛋白质结合显示了惊人的高量子产率，染料通过胆道系统排出，仅注射几天后，正常组织中几乎没有残留染料。与目前的NIR-II纳米材料荧光团不同，CH-4T显示完全从体内排泄，尽管速度比CH-PEG慢。CH-4T未引起明显的细胞毒性，而CH-4T/FBS-HT和CH-4T/HSA-HT在较高浓度时，细胞活力略有下降。然而，与Frangioni及其同事的开创性工作类似，通过调整NIR-II荧光团和蛋白质之间的相互作用强度来保持高的量子产量，同时采用诸如多离子和净中性探针等策略，可能会加快排泄动力学并减少体内非特异性结合。为NIR-I荧光团开发的同样合理的设计原则可以应用于NIR-II有机染料，以开发下一代造影剂和分子显像剂。
即使具有出色的NIR-I硅CCD探测器规格（例如，像素数、暗电流、读出噪声等），在InGaAs探测器上使用更长波长探头的NIR-II成像也提高了成像指标。由于目前没有硅探测器具有超过~1,000 nm的合适灵敏度，因此NIR-II中的生物医学荧光成像取决于InGaAs焦平面阵列探测器的出现。然而，与在Si相机上将探针发射从可见光（~350-600 nm）推向NIR-I（~650-900 nm）所获得的好处类似，开发明亮的长波长NIR-II探针（＞000 nm）提高了成像性能指标。在InGaAs检测器的宽波长范围内进行的内部比较显着说明了通过开发从850 nm (ICG)到1100 nm (HiPCO SWCNT)到1500 nm（激光汽化SWCNT）的更长波长探头，成像的改进。ICG和激光汽化SWCNT都在一个区域发射，InGaAs 量子效率同样降低了~30–40%，而 HiPCO SWCNT在~1100nm处的量子效率为~85%。这表明在逐渐变长的波长下成像质量的显着差异源于散射/自发荧光的减少，而不是检测器光谱灵敏度的变化。荧光团化学的基本进展在很大程度上推动了NIR-II成像领域，使InGaAs探测器在生物医学成像中更为普遍。虽然新一代InGaAs探测器可以均匀地提高所有NIR-II探针的灵敏度/SBR，但NIR-II光谱范围内的相对成像指标仍将受波长相关的光组织相互作用的支配。改进NIR-II荧光探针（即增加量子产率和NIR-II发射波长）应与改进InGaAs相机的持续创新同时进行。
NIR-II具有高帧率的血流动力学成像与其他血管流动成像方式(如激光散斑血流成像和光声成像(PI))相比具有一些优势。激光散斑血流成像是基于散射源的相干光散射产生的激光散斑模糊(称为归一化模糊(NB))测量来计算血流速度。当红细胞通过毛细血管时，激光后向散射干扰模式发生调制。激光散斑血流成像具有重要的临床潜力，因为它不需要外源性造影剂，但这种成像方式目前受到一些限制。激光通量的测量高度依赖于组织特性，这些特性可以因人而异或在不同的疾病状态下有所不同。无单位NB与毛细血管血流速度之间的相关性仅出现在一组狭窄的条件下。在视网膜血管成像过程中，这使得人与人之间甚至人的眼睛之间的血流速度无法进行轻易的比较。光声成像可以利用血红蛋白的强可见吸收，在不需要外源性造影剂的情况下测量血流速度。然而，由于其~10-100 mm的最小分辨率特征，光声成像在空间分辨率x46方面无法与荧光成像竞争。CH-4T的穿透深度(1-3 mm)结合高时间(50 FPS)和空间(~1 mm)分辨率，实现了从微血管到大血管大小的高保真血流动力学成像。应用高帧率NIR-II成像与CH- 4T进行肿瘤内的血流动力学可视化，循环肿瘤细胞的血管内跟踪或创伤后大脑微血管成像可能为疾病病理生理学提供关键的洞察力。除了提供绝对的血液速度，CH-4T的高亮度和长波长发射可能改善其他生物光学成像方式。例如，CH-4T的单光子共聚焦成像可能会突破当前可见/NIR-I/NIR-II荧光团可达到的穿透深度极限。
总之，作者开发了第一个基于小分子有机染料的NIR-II造影剂，具有1.1-11% 的超高量子产率（IR-26=0.05-0.5%）。与PBS中的CH-4T相比，带负电荷的磺酸盐基团能够与血清蛋白进行超分子结合，荧光增强110倍。加热CH-4T-蛋白质复合物导致荧光强度显着增强，表明通过优化染料-蛋白质相互作用可以增加亮度。体内血管成像以50 FPS 的速度进行，这是迄今为止NIR-II中最快的帧速率，曝光时间为2毫秒，以明确解析血管血流动力学。此外，在第一个和第二个NIR窗口中对深度为 ~5-8 mm的深部淋巴结成像清楚地证明了在更长波长下对深部解剖特征进行成像的好处。CH-4T首次说明NIR-II中的高量子产率染料是可能的。未来的工作将努力修改CH-4T以实现可共价连接的 NIR-II荧光团，其亮度可用于超高SBR体内分子成像。
参考文献
A high quantum yield molecule-protein complex fluorophore for near-infrared II imaging. Alexander L. Antaris,*, Hao Chen,*, Shuo Diao, Zhuoran Ma, Zhe Zhang, Shoujun Zhu, Joy Wang,Alexander X. Lozano, Quli Fan, Leila Chew, Mark Zhu, Kai Cheng, Xuechuan Hong, Hongjie Dai& Zhen Cheng. Nat Commun 8, 15269 (2017). https://doi.org/10.1038/ncomms15269
