内容提要
新型小分子探针的开发对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。在此，作者报告了一种新型的近红外(NIR-II)荧光探针QT-RGD。该探针由NIR-II发射有机荧光团和两个环(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)(cRGD)肽构建，可以特异性结合到肿瘤相关的αvβ3整合素，用于准确的肿瘤诊断和靶向治疗。同位素125I标记的探针具有良好的肿瘤靶向能力，并能发射密集的NIRII/光声(PA)/单光子发射计算机断层扫描(SPECT)信号，可对体内肿瘤进行特异性和敏感性的多模态可视化。更值得注意的是，该探针具有显著的光热转换效率和良好的光热稳定性，可用于小鼠模型肿瘤的有效成像引导光热治疗(PTT)。因此，作者设想他们的工作揭示了NIR-II/PA/SPECT成像和PTT的组合，将为提高肿瘤诊断的准确性和治疗效果提供一种有价值的手段。
研究开始于根据先前描述的方案合成探针QT-RGD。1,8-萘内酰胺与3溴丙基-1-炔反应得到化合物1，产率为72%。然后，甲基氯化镁与化合物1进行Grignard反应得到化合物2。2-氯-3(羟基亚甲基)环己醛-1-烯丙醛在醋酐中缩合得到化合物3，与4巯基苯酚反应得到化合物4，总收率56%。探针QT-RGD最终由化合物4与两个当量的含叠氮cRGD在二甲亚砜和水的混合物中通过铜催化的“点击”反应合成。对照探针MT由七聚氰胺荧光团组成，但不含肽cRGD。 研究两种cRGD在提高水溶性和肿瘤靶向性方面的作用。所有中间体和所需探针的纯度和结构通过分析核磁共振MALDI-TOF质谱确认。首先对QT-RGD水溶液的吸收光谱和荧光光谱进行了表征。如图所示，两种探针在700 ~ 1100 nm范围内具有相似的吸收光谱，在1042 nm和841 nm处有两个吸收峰，这应该分别归因于探针的单体和低聚体。808 nm激发下的荧光光谱显示，QT-RGD在1068 nm处明显具有强烈的NIR-II荧光，以IR-26为参比，定量子产率()为0.12% (QY = 0.05%，)，而MT由于水溶性较差，发射较弱，量子产率()为0.07%。这表明了明显的聚集导致的猝灭(ACQ)效应，通过动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)结果得到了证实。
为了研究探针在水溶液中的聚集行为，研究了QT-RGD在不同体积分数的水(fw) DMSO中的吸收光谱。探针QT-RGD在纯DMSO溶液中最初呈现出较宽的吸收带，吸收最大值在1055 nm，肩峰在930 nm。随着水分数的增加，在1055 nm处的吸收峰逐渐减小，而在930 nm处的吸收峰逐渐增大，当水分数增加到100%时，吸收峰达到最大值，这说明水可以诱导QT-RGD分子形成团聚体，形成小的纳米颗粒。TEM结果显示，纳米颗粒的平均尺寸为34.7±0.6 nm，而流体动力学尺寸为约51.7 nm。然后，使用880 ~ 1250 nm的各种长通滤光片拍摄QT-RGD和MT水溶液的NIRII荧光图像。在880、1000和1150 nm下，QT-RGD的荧光强度明显高于MT，进一步说明QT-RGD具有良好的水溶性和较高的荧光量子产率。为了研究探针的化学稳定性，QT-RGD和MT分别用不同类型的化学物质处理，如NaClO、维生素C、H2O2、谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸和NaHSO3。由图所示的吸收光谱可知，在相同条件下，QT-RGD的化学稳定性明显优于MT，这意味着引入cRGD多肽可以显著提高QT-RGD的化学稳定性。通过测定吸收光谱，研究了探针在血清中的稳定性。在10% FBS溶液中孵育0.5 h后，QT-RGD的吸收光谱曲线变化可以忽略不计，这意味着探针在血清中具有良好的稳定性。接下来，作者还对QT-RGD和MT进行了标准的光子漂白实验，并以临床批准的ICG为参考。结果清楚地表明，在连续的808 nm辐照下，QT-RGD和MT都表现出了优越的光稳定性，只有轻微的荧光衰减。在相同的条件下，ICG的荧光强度急剧下降了约95%，这高度说明探针QT-RGD和MT具有比ICG好得多的光稳定性。所有这些证据有力地表明，探针QT-RGD具有良好的化学稳定性和光稳定性，可用于生物成像应用。
针对体内应用，通过MTT测定和血液生化试验评估QT-RGD探针的细胞毒性。QTRGD对20 M以下的小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞的细胞毒性可以忽略不计。这两种类型的细胞在孵育24小时后，总体细胞活力保持在85%以上。血液生化分析结果显示，与急性毒性相关的各项参数均无显著差异。作者进一步探索了探头在体内血管成像的潜力。为健康小鼠静脉注射QT-RGD探针和MT对照小鼠后2分钟后肢血管NIR-II荧光图像。MT对照，QT-RGD在808 nm激发下具有高信噪比和高分辨率的深层血管清晰可见。为后肢血管的横截面强度分布图。通过高斯拟合半最大值全宽(FWHM)计算得到QT-RGD和MT对应的最大特征分辨率分别为0.43 mm和1.19 mm，表明QT-RGD具有较高的时间分辨率成像性能。所有这些结果强烈表明，QT-RGD在体内NIR-II深组织成像方面具有很大的潜力。
为了评估QT-RGD在体内肿瘤可视化方面的潜力，将探针QT-RGD或对照MT(100 M, 200L)分别静脉注射到携带4T1肿瘤的活雌性裸鼠尾静脉。随后，在808 nm激发下，功率密度为42 mW cm−2，以时间依赖性方式获得NIR-II荧光图像。显示接受QT-RGD的4T1肿瘤可以清晰可见，荧光信号在注射后约4 h达到最大强度，信号背景比(SBR)为8.2，而接受MT的对照组小鼠在肿瘤区域仅显示微弱的荧光。体外生物分布研究进一步表明，大部分QT-RGD主要聚集在肿瘤和肾脏，而MT的生物分布以肝脏为主，这可能是由于其水溶性差和靶向肿瘤的能力较差。这些结果很好地证明了探针QT-RGD可能用于体内肿瘤的精确定位。
根据探针在NIR-II区域的广泛吸收，作者设想它应该可以应用于PA成像和PTT应用。为了验证这一假设，作者首先测定了不同浓度的QT-RGD水溶液的PA信号。与预期的一样，QT-RGD水溶液在808 nm处的PA强度随着探针浓度的增加，QTRGD逐渐增强，在0 ~ 10 M的浓度范围内呈良好的线性关系，这表明QTRGD是一种良好的PA成像造影剂。接下来，在皮下4T1荷瘤小鼠中评估探针的体内PA成像性能。通过尾静脉注射QT-RGD(100 M, 200L)后的选定时间点记录PA图像。QT-RGD肿瘤的PA信号随时间显著增加，并在注射后8 h达到最大值，而接受MT的小鼠则检测到微弱的PA信号。作者计算出PA对QT-RGD和MT的肿瘤背景比(tumor -background ratio, TBR)分别为13.8和2.1 ，这与上述在体内NIR-II荧光成像结果高度一致。
为了进一步研究药代动力学行为，通过酚组用125I标记QT-RGD和MT(100 M, 200 L)，然后静脉注射到4T1荷瘤小鼠(n = 4)进行SPECT成像。两组小鼠的肿瘤放射信号随时间变化而测定。注射QT-RGD的小鼠信号逐渐增加，在注射后4小时达到最大值，约为2.02% ID/g。而对照组小鼠的放射活性明显降低，仅为0.19%。采用γ计数法测定两组小鼠不同时间点眼眶血标本的放射性信号。用双室模型拟合两种探针在血液中的衰减曲线。QT-RGD与MT存在明显差异，消除半衰期(t1/2，β)分别为2.41 h和10.09 h。综上所述，这些结果很好地证明了探针QT-RGD可以用于肿瘤的体内多模态NIR-II/PA/SPECT成像。
为了检测探针在体外条件下的光热效应，808 nm激光(1 W cm−2)连续照射水溶液中不同浓度的QT-RGD 10 min，并通过红外摄像机监测其温度升高。如图所示。QT-RGD随浓度的增加呈现明显的温升。当浓度为16 M时，探针的温升高达31°C，而纯水仅为1.3°C。计算得出QT-RGD的光热转换效率为36.5%，显著高于ICG(约3.1%)随着激光功率的增加，相同浓度的QT-RGD温度逐渐升高。进一步评价了QT-RGD的光热稳定性。QT-RGD溶液的加热行为在至少五个加热/冷却过程循环中显示出可以忽略不计的温度衰减。这些结果清楚地表明探针QT-RGD具有优良的光热转换效率和光热稳定性。接下来，分别通过活/死染色和MTT法来表征探针对4T1细胞的光热消融作用。结果如图所示。在808 nm激光照射(1 W cm−2,5 min)下，QT-RGD和MT细胞均能实现有效的热消融，而未照射的细胞几乎没有死亡，表明在黑暗中两种探针的细胞毒性可以忽略不计。在相同浓度下，与对照MT相比，QT-RGD具有明显的细胞毒性，这可能是由于αvβ3整合素介导的内吞作用增强了细胞摄取。综上所述，QT-RGD具有良好的体外光热效应。
由于探针的显著光热效应，作者进一步研究了QT-RGD的体内光热效应。将QT-RGD静脉注射到携带4T1肿瘤的活雌性裸鼠尾静脉。注射后4小时，肿瘤暴露于808 nm激光(1 W cm−2)。接受QT-RGD的肿瘤在808 nm照射10 min后局部温度迅速升高21.7 °C，而接受生理盐水(PBS)的对照肿瘤在相同剂量的激光照射下，局部温度仅升高8.2 °C。为进一步评估体内光热消融效果，将4T1 BALB/c荷瘤小鼠(~ 20 mm3)随机分为6组(n = 5)，分别为:接受PBS(记为PBS)的小鼠，接受PBS后808 nm激光照射的小鼠(记为PBS+808 nm)，接受QT-RGD的小鼠(记为QT-RGD)，接受MT后808 nm激光照射的小鼠(记为MT+808 nm)，接受c-RGD和QT-RGD后808 nm激光照射的小鼠(记为cRGD+QTRGD+808 nm)，接受QT-RGD后808 nm激光照射的小鼠(记为QT-RGD+808 nm)。通过在21 d内测量肿瘤体积来评估PTT疗效。PBS、PBS+808 nm、QT-RGD和MT+808 nm组的肿瘤大小增加的方式非常相似，而cRGD+QT-RGD+808 nm组的肿瘤生长抑制作用非常弱。与之形成鲜明对比的是，QT-RGD+808 nm组的肿瘤在808 nm照射后有效缩小，直至全部5个肿瘤被完全消除。不同处理的小鼠存活率见图。QT-RGD+808 nm组生存率明显提高，36 d内无一例死亡。处理后3 d提取肿瘤部位组织，苏木素和伊红(H&E)染色。与对照组相比，实验组出现了严重的坏死和广泛的核固缩，进一步验证了QT-RGD在体内良好的PTT疗效。此外，在21天的治疗期间，所有小鼠的体重没有明显下降。实验组主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色图像显示，与对照组相比，未见明显损伤和肺转移。总之，所有这些证据强烈表明，除了多模态NIRII/PA/SPECT成像外，探针QT-RGD可能是一种通过PTT有效治疗癌症的有前景的工具。
总结
总之，通过将NIR-II发射性有机荧光团与两个亲水性cRGD多肽结合，作者成功地开发了一种新型的肿瘤靶向NIR-II荧光探针。该探针可在水溶液中形成均匀的纳米颗粒，具有明亮的NIR-II荧光，强PA和SPECT信号，可通过合理的NIRII/PA/SPECT多模态成像实现对肿瘤的无创伤精确定位。更值得注意的是，在体外和体内的研究都证明了探针QT-RGD由于其显著的光热效应，对肿瘤的有效PTT具有突出的能力。因此，作者相信本研究为恶性肿瘤的准确诊断和有效治疗提供了一个有前景的工具。
参考文献
Novel αvβ3 Integrin-Targeted NIR-II Nanoprobe for Multimodal Imaging-guided Photothermal Therapy of Tumor In Vivo . Meng Zhao, Jianan Ding, Qiulian Mao, Yuqi Zhang, Yinjia Gao, Shuyue Ye, Hongni Qin and Haibin Shi. Nanoscale.2020, 12 (13), 6953-6958. https://doi.org/10.1039/C9NR10720G
