内容提要
通过第二近红外窗口(NIR-II, 1000 ~ 1700 nm)的黄嘌呤荧光生物成像因其穿透深度和高对比度而备受关注。然而，探索新型荧光材料，特别是波长长、亮度高的小分子荧光团仍然是一个相当具有挑战性的问题。通过扩展π共轭和增强分子内电荷转移效应，作者报道了一系列新的杂蒽基NIR-II染料，命名为VIXs。其中，VIX-4的荧光发射波长为1210 nm，荧光亮度高，可用于小鼠200 fps的血流动态成像。利用动态成像的高时空分辨率，作者通过血流方向直接区分动脉和静脉，并通过视频测量血流体积。该研究不仅为高时空分辨率的生物成像提供了一种有效的工具，而且为NIR-II染料提供了一种新的、有前景的共轭骨架。
结果与讨论
设计和合成。放大共轭结构是实现荧光探针吸收/发射波长红移的有效方法。为此，用sp2碳取代3 '，6 ' -羟基是延长黄烷共轭的最直接方法。虽然苯酚取代荧光素的羟基已有报道，但其发射波长仅为538 nm.最近的一项进展是使用1-甲基-2-苯基吲哚嗪修饰黄烷核，产生NIR-II荧光团，发射波长为1092 nm.然而，如何开发长波长的杂蒽基NIR-II荧光团仍然具有挑战性。在目前的工作中，作者探索了将两个苯乙烯基同时偶联到荧光素的3 '，6 '位置以扩展共轭结构。分子设计的另一个考虑因素是分子内电荷转移(ICT)机制在激发态中，具有最高占据分子轨道(HOMO) -最低未占据分子轨道(LUMO)分布的分子可能发生电子转移，从而产生较大的Stokes位移和红移荧光。因此，羟基苯乙烯基(VIX-1)、甲氧基苯乙烯基(VIX-2)、N,N-二甲基苯乙烯基(VIX-3)和julidinestyryl (VIX-4)这4个给电子能力逐渐增强的对取代苯乙烯基被加入到黄烷核中，形成D−A−D构型。作者预计后两个给电子能力更强的含氮基团比前两个含氧化合物具有更长的波长。
从合成的角度来看，C−C耦合反应是构建共轭结构的关键。目前常用的合成方法有Knoevenagel缩合法和Suzuki偶联法。另一种方法如Heck反应(通常是乙烯基在钯的催化下与卤苯偶联)也可能用于合成新的共轭荧光团。通过Heck反应，可以通过将3 '，6 ' -二碘氟烷与对取代苯乙烯基偶联制备VIXs。得到的化合物呈白色或淡黄色，在330 - 395 nm处显示紫外吸收(图S1)，表明它们处于螺旋内酯构象中，类似于许多荧光素或罗丹明衍生物为了抑制内酯化，这些化合物进一步与乙醇酯化。最终产物为暗色固体，并表现出更长的吸收波长，表明它们处于光谱“开启”状态。
光谱性质。波长和亮度是获得高质量图像的关键因素。图为VIXs在各种溶剂中的光谱图，详细的光物理数据列于表S1。每种染料显示的最大吸收比荧光素长得多，表明黄烷共轭结构的成功延伸。值得注意的是，VIX-4在NIR-II窗口1028 nm处显示了明显的红移吸收。另一方面，VIXs在CH2Cl2和CHCl3中表现出较强的荧光发射，而在水缓冲液中几乎没有荧光，表现出极性依赖的荧光。其中，VIX-3和VIX-4在CHCl3中分别在1040和1180 nm处显示NIR-II荧光;在CH2Cl2中，VIX-4甚至在1210 nm处发出荧光。值得注意的是，除了作者之前报道的FM1210外，有机荧光团发射超过1200 nm是极其罕见的。VIX-3和VIX-4的另一个优点是它们的大斯托克斯位移，这可以大大减少激发光的干扰。与荧光素或多甲基染料相比，在不同溶剂中，VIX-3和VIX-4的Stokes位移在137到417 nm之间。VIX-3的亮度为580 M−1 cm−1，摩尔吸收系数为1.38 × 105 M−1 cm−1，量子产率为0.42% (IR26 = 0.05%为标准)VIX-4为61 M−1 cm−1，摩尔吸收系数为2.34 × 105 M−1 cm−1，量子产率为0.026%。波长较长的VIX-4的量子子产额低于VIX-3，这可能是由于前者根据能隙定律增加了非辐射率所致。值得注意的是，VIX- 4显示出比FM1210 (~ 10 M−1 cm−1)高6倍的亮度，这是由于与BBTD染料相比，黄烷染料的摩尔吸收系数更高这些优越的NIR-II荧光特性是非常有利于深穿透和低背景成像。
分子的计算。通过分子计算可以解释vix的长吸收波长和大Stokes位移。利用B3LYP函数和6-31G*基集进行密度泛函理论(DFT)和随时间变化的密度泛函理论(TD-DFT)计算，得到优化的几何形状。HOMO和LUMO如图所示。可以看出，末端氧/氮原子上的孤对电子高度参与了离域π键，而HOMO大部分被定域在苯乙烯基上;同时，lumo相对集中在黄烷核上，产生了显著的ICT效应。作为对照，罗丹明B的HOMO和LUMO都位于黄烷结构上，表明存在局域激发。随着染料从VIX-1到VIX-4的红移吸收，HOMO和LUMO之间的能隙减小，而罗丹明B的能隙最大。另外，为了解释末端为氮原子的VIX-3或VIX-4的波长比末端为氧原子的VIX-1或VIX-2的波长长得多的原因，从TD-DFT计算中进行了电子-空穴分析。光激发后，末端氮的电荷密度差约为17%，而末端氧的电荷密度差约为8%，表明氮原子的给电子效应明显更强。以上结果验证了扩展π共轭和增强ICT效应的设计策略的有效性。
体内成像。体内成像实验采用VIX-3和VIX-4。因为它们在水介质中几乎没有荧光，所以用DSPE-mPEG2000包裹在脂质体中，在HEPES缓冲液中荧光。然后，将脂质体注射到小鼠体内进行体内成像。通过1150长通(LP)滤波器和1300低通(LP)滤波器获取图像。对于这两种滤波器，VIX-4产生的图像比VIX-3更清晰，在腹部和股血管的放大图像中可以更清晰地看到VIX-3。同时，小鼠的背景荧光图像显示，808 nm激发产生的背景比980 nm激发产生的背景更强烈，导致信号背景比更低。因此，将980 nm激发的VIX-4进一步应用于高速动态NIR-II成像。在此之前，作者对VIX-4脂质体的环境效应和光稳定性进行了检测，发现其稳定性良好。测定脂质体的体内半衰期约为59 min。此外，通过血液检测，对小鼠的VIX-4脂质体无明显毒性。
血液循环系统的动态成像。具有高时间分辨率的荧光成像是体内成像的难点由于光子被组织吸收和散射，长时间的曝光时间(几十到几百毫秒)对于积累足够的光子以达到可接受的信噪比(SNR)是必不可少的由于VIX-4的波长长、亮度高，作者探索了它在高速动态成像中的应用。作者首先以100帧/秒的速度从腹侧视角监测VIX-4在血流中的扩散过程。视频S1显示了尾静脉注射后的腹侧前30 s图像，代表性图像如图4A所示。作者观察到，在最初的0.32 - 0.69 s内，心脏被点亮并跳动了三次。0.69 s后，将VIX-4泵入肺叶。然后，从近端到远端照射四肢。随后，颈静脉和肠系膜血管被照亮。10 s后，染料分布于整个循环系统，并在肝脏内大量积累。通过强度-时间图，还可以观察到一些典型器官(心脏、肺、肠系膜和肝脏)的光照时滞。此外，根据S1视频，可以区分运动的肠系膜血管和不运动的浅表血管(前者随呼吸节律运动，后者不随呼吸节律运动)。
在背侧视图中，肺叶、肢体血管、大脑和脊柱依次被点亮。再从下背部、颈部至中背部(心脏附近)照射背部浅表血管，与血流方向一致。此外，作者不仅可以根据血流方向区分动脉和静脉，甚至可以捕捉到含有染料的动脉血的前两次脉冲。
值得注意的是，低至5 ms的曝光时间(ET)足以获得清晰的图像。显示了200帧/秒(ET = 5 ms)、150帧/秒(ET = 6.6 ms)和100帧/秒(ET = 10 ms)下记录的图像的信噪比对比。即使使用5 ms ET，得益于VIX-4优越的亮度，其信噪比也在10以上。此外，作者以640 × 512像素，200fps的速度对小鼠全身进行了成像，从中可以确定心率为220次min - 1，并可以解决心房和心室跳动之间0.11 s的延迟。
高时空成像血流容量测量。通过影像学方法直接确定血流量是具有挑战性的，但也是有益的。这种测定需要评估血管直径和流速，这反过来又要求同时具有高的空间和时间分辨率，特别是对高速动脉血液然而，荧光成像通常牺牲一个参数来改善另一个参数VIX-4在实现血流容量测量的高时空成像方面表现出良好的平衡。如图为20 ms, ET和50 fps，在横切面1处分辨出两条并置血管和三条分支。然而，作为对照实验，ICG在体内成像只能得到模糊的图像。通过高斯拟合，可以通过半最大值处的全宽度(FWHM)近似确定血管的直径。为了研究组织散射对血管直径测定的影响，填充了VIX-4的玻璃毛细血管(直径0.6 mm)浸泡在脂质内溶液(0.2%)中，然后成像，这表明不同散射水平的毛细血管的半高宽(约0.7 mm)没有显著变化。另一方面，在夹取大腿血管时，由于血流受阻，一条血管扩张(鉴定为股静脉)，而另一条血管收缩(鉴定为股动脉)。开刀后，由于血流再通，动脉扩张，静脉变窄。这些结果表明，VIX-4具有显著的空间分辨率。
此外，在对应的视频中，可以直接观察到动脉内近端至远端血流和静脉内反向血流。这一观察结果可以通过主成分分析(PCA)进一步验证，PCA根据图像像素的方差对其进行分组。横切面2处的动脉和静脉直径分别为0.30 mm和0.25 mm。作者研究了沿每条血管的四个位置的强度-时间关系，并用sigmoid函数对数据进行拟合。将感兴趣区域(ROI)强度增长最快的时间点定义为流量前沿到达感兴趣区域的时间点。然后，流动前缘的距离-时间图在动脉和静脉中都表现出良好的线性关系，由此计算出的流速分别为17.1 mm/s和3.7 mm/s。也就是说，通过截面2的血流量，动脉为0.072 mL/min，静脉为0.011 mL/min。虽然已有报道显示NIR-II血流显像，由于空间分辨率的限制，很难直接区分平行股动脉和平行股静脉。另一方面，由于时间分辨率不足，动脉内的快速血流不能被显示。在作者的实验中，VIX-4展示了卓越的时空分辨率，完成了以前无法实现的测量。
结论
总之，作者报道了一系列新的黄烷染料VIXs，具有NIR-II荧光发射和高亮度。通过在黄烷核的3 '，6 ' -位置加入对取代苯乙烯基，使π-共轭增大。增强苯乙烯对位上的给电子能力可以有效地提高染料的波长。在VIXs中，VIX-4在1210 nm处表现出NIRII荧光，Stokes位移大，亮度高。作者使用VIX-4，以高达200帧/秒的帧率对小鼠全身的血液循环系统进行高速动态成像监测。最后，通过高时空成像直接测定股血管的血流容量。本研究不仅为高时空分辨率的生物成像提供了重要手段，而且为未来NIR-II荧光探针提供了新的有用的框架。
参考文献
Xanthene-Based NIR-II Dyes for In Vivo Dynamic Imaging of Blood Circulation. Diankai Liu, Zixu He, Yanyan Zhao, Yuantao Yang, Wen Shi,* Xiaohua Li, and Huimin Ma. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 17136−17143. https://doi.org/10.1021/jacs.1c07711
