内容摘要
开发具有优异的水溶性和化学/光稳定性的小分子第二近红外窗口(NIR-II)染料是非常重要和具有挑战性的。在这里，作者发现了一种在碱性条件下具有最高稳定性的电子受体6,7-二（噻吩-2-基）-[1,2,5]噻二唑[3,4-g]喹啉(TQT)，与传统的近红外-II构筑基团苯并双噻二唑(BBT)和6，7-二苯基-[1，2，5]噻二唑[3，4-g]喹恶啉(PTQ)相比。进一步合成了磺化亲水性染料FT-TQT，其量子产率是以BBT为受体的同类化合物FT-BBT的2.13倍。还制备了与FBS络合的FT-TQT，其荧光强度是单独FT-TQT的16倍。它展示了具有微米级分辨率的实时脑血管和肿瘤血管成像能力。通过NIR-II荧光成像实现了药物治疗后肿瘤血管破坏的动态监测。总体而言，TQT是设计创新的NIR-II染料的有效电子受体。受体工程策略为设计新一代NIR-II荧光团开辟了新的生物医学应用领域提供了一条很有前途的途径。
结果与讨论
大多数已报道的NIR-II D-A-D水溶性荧光团，包括CH1055-PEG、CQ-4T、IR-E1、IR-FP8P和TPA-T-TQ纳米粒子，都是以BBT和PTQ为电子受体。作者的研究选择了三种电子受体(BBT、PTQ和TQT)，并首先研究了它们的光学性质。通过对BBT-2Br、TQT-2Br和PTQ-2Br在二氯甲烷中的吸收光谱的研究，作者发现受体的吸收发生了显著的红移，这可以归因于HOMO能级的提高。然而，发射光谱从PTQ2Br，TQT-2Br略微红移到BBT-2Br。
此外，对BBT-2Br、TQT-2Br和PTQ-2Br在酸碱条件下的稳定性进行了评估。BBT-2Br、TQT-2Br、PTQ-2Br在酸性条件下稳定。然而，在BBT-2Br溶液中加入三乙胺(TEA)后，溶液的外观立即从粉红色变成黄色。同时，由于BBT-2Br在碱性条件下的分解，在高效液相色谱法(HPLC)中出现了一个新的峰。此外，随着碱浓度的增加，PTQ-2Br的峰面积也略有减少。相反，在碱性条件下，TQT-2Br的溶液外观和高效液相色谱光谱几乎没有变化。结果表明，与BBT-2Br和PTQ-2Br相比，TQT-2Br对基本合成环境最稳定。考虑到TQT-2Br的光化学性质，TQT-2Br是理想的受体，具有适当的红移和良好的稳定性。为了进一步探索具有不同电子受体的完整D-A-D荧光团的稳定性，合成了TPA-TQT。TPA-TQT和CH-4T(以BBT为受体)在水中的吸收和发射光谱如图所示。与CH-4T相比，TPA-TQT有明显的蓝移，不利于近红外成像。TPA-TQT和CH-4T在连续808 nm激光照射1h下都表现出较高的光稳定性。分别描绘了TPA-TQT和CH-4T在不同pH值(7.4，8.0和8.5)的PBS处理前后的吸收光谱和照相溶液。经808 nm激光照射后，CH-4T在PBS(pH 8.5)中的最大吸收强度较原值下降约83%。相反在808 nm激光照射下，TPA-TQT的吸收光谱和溶液外观几乎没有变化。这些结果表明，TPA-TQT对基本环境具有高度的抵抗力，这是稳定和准确的活体成像(例如，胰腺(pH 8.35-8.45)、大肠(pH 8.4-8.55))的理想选择。
为了探索受体结构与荧光性质之间的关系，作者首先对BBT、PTQ和TQT结构的D-A-D荧光团(FTs)进行了理论计算，其中相同的9，9‘-二烷基取代荧作供体。结果表明，FT-TQT和FT-BBT具有相似的禁带宽度(ΔE=~1.3 eV)，比FT-PTQ(ΔE=~1.6 eV)窄得多。这可以归因于TQT和BBT更强的电子提取能力。根据结果和理论计算，作者合成了BBT和TQT荧光团。
组装目标化合物核心结构的关键步骤包括Suzuki交叉偶联反应、锌还原和环合。为了提高FT染料的水溶性，在化学结构中引入了四个磺酸基。详细的合成过程和表征在支持信息中描述。
为了考察BBT和TQT染料在活性氧/氮物种(ROS/RNS)、金属离子和活性生物分子存在下的化学稳定性，作者测量了CH-4T、FT-BBT、TPA-TQT和FT-TQT在37°C孵育1小时后的吸收光谱。结果表明，所有染料在金属离子(K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+)和活性生物分子(GSH、Cys、Hcy、抗坏血酸(AA)、脱氢抗坏血酸(DHA))存在下都是稳定的，而CH-4T在Ga2+和Fe2+存在下发生红移。然而，在ROS/RNS存在下，BBT染料表现出比TQT染料更差的稳定性，尤其是ClO−。为了评价四个荧光团的碱稳定性，首先测试了四个荧光团在不同碱性溶液中不同时间点的吸收光谱。CH-4T在1% NaOH、1% TEA、1% DIEA等不同碱液中的稳定性最差。在1% NaOH、1% TEA和1% DIEA中，第7天的降解率分别为98%、76%和70%。另一种基于BBT的染料FT-BBT在碱性溶液中的稳定性高于CH-4T，说明给电子体对NIR-II染料的稳定性有一定的影响。然而，FT-BBT在1% NaOH中仍有部分分解(第7天为28%)。毫无疑问，基于TQT的NIR-II染料、TPA-TQT和FT-TQT在所有测试的碱性溶液中表现出最好的稳定性。此外，作者还评估了FT-BBT、TPA-TQT和FT-TQT在不同质量浓度的NaOH溶液中的吸收曲线变化。在5%NaOH溶液中，FT-BBT孵育24 h后降解率为42%，TQT染料在5% NaOH溶液中仍保持稳定，表明TQT染料可广泛应用于不同碱性条件下的化学改性。CH-4T、FT-BBT、TPATQT和FT-TQT在pH 5.0-10.0的37°C水浴中孵育。当在pH 8.5下孵育24 h时，近一半的CH-4T会分解，而TPA-TQT和FT-TQT在pH 8.0和pH 8.5下孵育96 h后保持稳定。此外，TPATQT和FT-TQT在甲醇和小鼠血清中表现出超高的光化学稳定性。然而，在相同浓度的水中，FT-TQT的荧光强度是TPA-TQT的9.6倍。同时，FT-TQT在37°C与小鼠血清孵育1h后，荧光强度增加了8.2倍，因此，考虑到发射波长和稳定性，作者选择FT-TQT和FT-BBT作为下一步的研究对象，比较了BBT和TQT染料的光学性质的差异。
图中的NIR-II荧光图像定性地显示了FT-BBT和FT-TQT之间不同的亮度级别，都在808 nm(OD 0.1)处具有匹配的吸光度。定量地说，在1100 nm、1250 nm和1350 nm的LP滤光片上，FT-TQT的荧光强度分别是FT-BBT的6.6、4.9和2.3倍。FT-BBT和FT-TQT的吸收光谱显示FT-BBT和FT-TQT的激发峰在~845 nm和~770 nm。同时，FT-TQT显示发射峰在1034 nm，尾巴延伸到NIR-IIa区(1300-1400 nm)。然而，在相同的浓度(10 µM)和条件(808 nm)下，FT-BBT几乎不发射荧光。在甲醇中，FT-TQT、FTBBT和目前的近红外染料CH-4T的量子产率分别为0.49 %、0.23 %和0.11 %。溶剂选择甲醇而不是水，因为FT-BBT在水中的量子产率无法检测到(以IR-26为参考，QY=0.05%)。此外，通过将ICG、FT-BBT和FT-TQT分别在去离子水中连续激光照射1h，观察到FT-BBT和FT-TQT具有优异的光稳定性。当充满FT-BBT和FT-TQT溶液的毛细管在不同过滤器(1300 nm和1500 nm)下以增加的模体深度浸泡在1%的脂内溶液中时，FT-TQT的生物成像结果比FT-BBT的毛细血管边缘更清晰，深度可达7 mm。随着穿透深度的增加，所有荧光团的图像强度衰减和毛细管轮廓模糊。此外，与FT-BBT相比，FT-TQT的毛细血管横截面轮廓显示出明显的特征完整性，这可归因于FT-TQT的更高亮度。
在估计了FT-BBT和FT-TQT的光学性质后，作者转向了体内的NIR-II研究以进行进一步的筛选。高倍率的后肢血管网络可以在1400 nm的亚NIR-II窗口分辨出来。毫不奇怪，与FT-BBT相比，FT-TQT对血管成像产生了更高的对比度。总之，FT-TQT在体外和体内的表现鼓励作者在接下来的实验中探索其成像潜力。
淋巴引流在肿瘤转移中起着至关重要的作用。为了研究NIR-II生物医学成像在体内淋巴引流中的作用，将FT-TQT皮内注射到正常裸鼠的足垫。注射后，可以清楚地看到拥挤的侧支淋巴管。4条淋巴管的直径从226到322μm清晰可见。此外，窝淋巴结及其传入淋巴管也很容易辨认。结果表明，FT-TQT在淋巴成像方面具有良好的应用前景。
可视化血管结构的准确解剖信息是实时跟踪血液循环系统的前提，有助于了解其功能障碍。NIR-II血管成像是通过静脉注射FT-TQT(200 μL，1 mg mL−1)到Balb/c小鼠体内进行的。整个血管成像在1000~1400 nm的连续长通滤光片上显示，曝光时间逐渐增加。波长较长的血管比波长较短的血管更明显，这是因为组织对较长波长的吸收、散射和自体荧光较低。此外，FT-TQT具有相当长的血液半衰期(~10h)，这可能是由于FT-TQT与血清蛋白(如白蛋白46)的相互作用造成的。在注射后10小时，血液中FT-TQT的荧光信号仍然可以在1400 nm子窗口上检测到。如此长的血液滞留时间可用于长期准确的血管监测，并有利于荧光团在靶组织中的积累。值得注意的是，荧光信号主要可以在肝脏中观察到，这为诊断肝病提供了可能性。由于FT-TQT的高亮度和长循环特性，成功地进行了高分辨率的全身血管成像，启发了作者进一步评估血管相关疾病。
为探讨FT-TQT的毒性，采用标准的四甲基偶氮唑盐比色法对小鼠胚胎成纤维细胞系3T3和人骨肉瘤细胞系143B进行了体外毒性评价。在与FT-TQT孵育24小时后，即使在高达100微米的浓度下，两种细胞也没有明显的细胞毒性，表明其低细胞毒性和良好的体外生物相容性。接下来，作者通过给正常Balb/c小鼠注射FT-TQT(100 μL，1 mg mL−1)来评估其体内毒性。给药后第7天和第14天分别监测体重和血清生化指标。作者观察到FT-TQT治疗组和对照组在体重或血液标记物方面没有明显差异。用NIR-II显像评价FT-TQT的生物分布。结果显示，在静脉给药后7天和14天，染料主要聚集在肾、肝和脾中(。主要脏器的H&E染色显示，FT-TQT治疗后没有明显的病理变化。总的来说，FT-TQT的生物相容性良好，在临床翻译中显示出良好的前景。
脑微血管成像是了解脑血管疾病的一种实用方法，如创伤性脑损伤、中风和血管性痴呆。在近红外-II窗口中具有高量子产率的荧光团在可视化脑血管系统方面具有很大的前景，脑血管系统位于比皮肤表面更深的位置(≈1.3 mm)。据报道，含磺酸官能团的NIR-II染料很容易与血浆蛋白形成超分子组装，从而显著增加荧光亮度。有趣的是，FT-TQT的荧光信号只有在胎牛血清(FBS)存在时才明显增加。FT-TQT/FBS加热到70℃ 10分钟的相对荧光亮度称为FT-TQT@FBS加热，分别是FT-TQT/PBS、FT-TQT/FBS和FT-TQT/HSA的16倍、8倍和11倍(FT-TQT@FBS的制备方法和表征见。进一步证明FT-TQT与小鼠全血和红细胞的相互作用很小，因为它们的近红外信号与FT-TQT/PBS几乎没有变化。因此，作者使用FT-TQT@FBS对脑血管进行成像。结果，通过完整的头皮和头骨可以清晰地看到微小血管的高分辨率。为了获得详细的解剖信息，脑血管的FWHM值被计算为117微米和119微米(1300 nm LP)。这些数据表明，FTTQT@FBS在深部组织的NIR-II血管成像中具有显著的优势。为了评价FTTQT@FBS的生物相容性，在静脉注射后第7天和第14天进行了重要器官的NIR-II成像。与FT-TQT相比，FT-TQT@FBS在肝脏中分布最广，颗粒较大，不易从肾脏排泄。而FT-TQT主要分布在肾脏，其次是肝脏。此外，经FT-TQT@FBS处理后，主要脏器的H&E染色未见明显病变。
肿瘤的生长和转移与血管生成密切相关。为了可视化裸鼠移植骨肉瘤的血管网络，作者随后使用FT-TQT@FBS进行了高对比度实时NIR-II成像。记录的小鼠肿瘤血管的NIR-II视频在1100 nm的亚NIR-II窗口产生了超对比度血管成像。首先，肿瘤的主血管及其传入的不规则血管分支容易辨认，具有典型的肿瘤血管特征。肿瘤的主要血管的荧光强度随着时间的延长逐渐减弱。然后，计算出不同滤光片的血管(黄色虚线)的FWHM值分别为114微米(1100 nm LP)、102微米(1350 nm LP)和233微米(1100 nm LP)。最后，使用基于改进的Hessian矩阵法的血管量化算法评估不同时间点的肿瘤血管密度。注射FT-TQT@FBS后，肿瘤血管密度随着丰富的分支被点亮而逐渐增加。这些数据共同表明，FT-TQT@FBS提供了令人印象深刻的血管分辨率，并激励作者拓宽与血管相关的治疗评估。
血管将氧气和营养物质输送到身体的每一个部位，但也滋养癌症。选择性地切断血液供应并使肿瘤挨饿已被证明是一种有效的治疗策略。肿瘤血管干扰剂(VDA)，康泰素A4磷酸(CA4P)，迅速导致肿瘤血管关闭，随后触发肿瘤细胞死亡的级联反应。为了监测给予CA4P后肿瘤血管的破坏情况，作者使用FT-TQT@FBS对裸鼠移植骨肉瘤血管进行了实时近红外成像。在对照组(未经CA4P治疗)，FTTQT@FBS复合体PI 5min后可见不规则的肿瘤血管。毫不奇怪，直到35分钟，肿瘤的血管形态都没有明显的变化。治疗组在注射CA4P(10 mg kg−1)30 min后，注射FT-TQT@FBS，并获得高保真的肿瘤血管实时图像。血管的形状逐渐模糊，直到随着时间的推移而消失。此外，还测量了同一位置的肿瘤血管的横截面轮廓。随着时间的推移，由于CA4P切断肿瘤血管的作用，无法分辨出两条肿瘤血管。这些结果证明了FT-TQT@FBS用于评估肿瘤血管破坏的可行性，突出了其在评估血管阻断药物疗效方面的潜在应用。
结论
目前临床上使用的医学成像方式主要是断层扫描技术，如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。然而，上述断层成像方式的关键限制包括危险的电离辐射、固有的有限的时空分辨率和较长的成像时间。相比之下，NIR-II荧光成像与其他医学成像方式相比有几个优势。尽管NIR-II窗口的穿透深度仍然明显低于CT、PET和MRI，但它在广场成像中可以提供快速反馈、非电离辐射和微米级分辨率。到目前为止，无机荧光团，包括碳纳米管、量子点和稀土纳米粒子，已经被广泛用于临床前动物NIR-II成像。然而，由于无机荧光团中重金属的潜在毒性，开发有机NIR-II染料以便于FDA批准和临床翻译将是当务之急。然而，大多数已报道的NIR-II有机荧光团是疏水的，需要被包裹在聚合物基质中，体内清除速度慢，不可能制造GMP(良好制造规范)，这远远不能用于临床翻译。由于合成和提纯的繁琐，很少有研究开发出水溶性NIR-II小分子染料。然而，水溶性小分子染料仍然是临床转化的主要候选者，如吲哚青绿(ICG)。吲哚青绿(ICG)是第一个被批准用于人类的近红外荧光团。由于在近红外II区(∼1500 nm)有很长的发射尾巴，ICG最近被用于肝脏肿瘤患者的第一次近IR-II成像，这促进了近IR-II成像的临床翻译。然而，临床使用的ICG存在严重的光漂白和较差的光稳定性。因此，开发具有优良的水溶性、化学/光稳定性、较长的吸收/发射波长和良好的生物相容性的先进的NIR-II试剂仍然是一个瓶颈。有机NIR-II荧光团的分子结构工程可以为其光学性质提供强大的可调性。在过去的五年中，D-A-D近红外-II染料被广泛用于活体成像。为了获得更好的NIR-II D-A-D染料的性能，人们已经致力于供体工程。然而，值得注意的是，对接受者结构的关注要少得多。在本工作中，作者报道了一种新的电子受体TQT，并证实了TQT具有比BBT和PTQ更高的碱稳定性。同时，在pH 8.5的PBS中，TPATQT表现出比已报道的以BBT为受体的NIRII染料CH-4T更高的稳定性。此外，在甲醇中，FT-TQT(0.49 %)的量子产率高于FT-BBT(0.23 %)和CH-4T(0.11 %)。将FT-TQT负载到FBS中后，FT-TQT@FBS的相对荧光亮度分别是碳纳米管(QY=0.04 %；IR-26=0.05 %)、CH-PEG(QY=0.03 %；IR-26=0.05 %)和IR-26(QY=0.05 %)的5倍、6.6倍和4倍，量子产率是FT-TQT在水中的8倍。因此，本工作阐明了采用受体工程策略开发高性能、高稳定性、高亮度的近红外分子荧光团的可行性。实时动态血管造影术可以提供解剖和血流动力学信息，可以加深作者对血管疾病的理解，评估新的治疗方法。显微CT(Micro-CT)和MRI通常用于血管结构成像。然而，上述方法受限于长扫描、有限的空间分辨率或高辐射剂量和后处理时间。对于血管血流动力学，激光多普勒虽然可以提供较高的时间分辨率，但由于其空间分辨率差，对比度低，不能准确地确定血管的直径。这项研究表明，NIR-II成像技术能够进行高分辨率的结构性血管成像，包括循环系统、淋巴引流以及大脑和肿瘤的血管网络。一个更突出的发现是，通过NIR-II荧光成像首次识别了对康泰素A4磷酸(CA4P)治疗后肿瘤血管破裂的实时监测。在目前的工作中，水溶性探针FT-TQT显示出优越的成像性能，但其在体内的清除相对较慢。肾透明光学制剂的开发可能是解决这一问题的有效途径，因为它可以在代谢降解很小的情况下快速从体内排泄。通过将有机荧光团与菊粉、环糊精、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇60(PEG60)等水溶性部分连接起来，可以实现肾脏的清除。同时，用靶向多肽或抗体修饰有机荧光团将进一步扩大这些荧光团的应用。综上所述，本工作描述了一种新型的电子受体--TQT，它比BBT和PTQ具有更好的性能。一种小分子有机NIR-II荧光团FT-TQT实现了体内快速、高分辨率和实时的血管成像。优化的蛋白质复合体FT-TQT@FBS可用于对CA4P治疗后的动态血管过程进行静态或持续成像，包括脑血管、肿瘤血管和肿瘤血管破裂。FT-TQT为监测血管相关疾病和评价血管相关治疗的疗效提供了有力的工具。分子工程策略为设计以TQT为受体的新型NIR-II荧光载体开辟了新的领域。
参考文献
Acceptor engineering for NIR-II dyes with high photochemical and biomedical performance. Aiyan Ji, Hongyue Lou, Chunrong Qu, Wanglong Lu, Yifan Hao, Jiafeng Li, Yuyang Wu, Tonghang Chang, Hao Chen & Zhen Cheng .Nat Commun 13, 3815 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31521-y
