内容提要
最近的研究表明，使用波长在1000到2000 nm之间的波长，即短波-红外或近红外(NIR)-II范围，可以实现传统光学波长无法实现的深度的高分辨率活体成像。然而，很少有这种类型的生物共轭探针被证明在可见和近红外范围内的多路成像是无价的，可用于这些波长的成像。利用合理的设计，作者通过儿茶酚环和芳基环融合分别在非甲胺支架上生成了吸光度最大在872和1072 nm的全磺化吲哚菁染料。在多个肿瘤模型中使用单克隆抗体和右旋糖酐偶联物进行多色双色和三色体内成像，说明了同时标记肿瘤和周围健康组织和淋巴的好处。这些努力的实现得益于定制的近红外/短波红外成像装置和多色实时成像软件包的互补进展。
结果
计算设计、合成和表征。为了帮助设计取代非甲基川花菁，作者首先进行了计算分析，以探讨取代基对模型非甲基川花菁支架的影响。这些研究表明，邻苯二酚融合和脱氢十烷基取代结合形成了一个平面的多甲基发色团，具有传统的类菁HOMO和LUMO轨道，预测的吸光度最大值为933 nm。更引人注目的是，C4 ' /C6 '位置的芳基环融合，由于稳定了附加芳基上增加的LUMO密度，提供了超过1,000 nm的预测吸光度最大值。
这些化合物的过磺酸变异体在一个简洁的序列中被访问。四磺化二氯衍生物1，作者预计将是一个有用的合成中间体，在计算结构的过程中，通过两步制备。然后，化合物1通过与3,4-二羟基苯甲酸2在水条件下(PBS)反应进行功能化，以64%的收率获得FNIR-866，或通过铃木交叉偶联双硼酸3以35%的收率获得FNIR-1072。
详细研究了FNIR-866和FNIR-1072的光谱和光物理性质。在这个波长范围内，探针的发射由于溶剂竞争性地钝化激发态而降低——作者也观察到了这一趋势37。例如，FNIR-866的亮度值(ε× ΦF)为7300(甲醇)，约为ICG(16000)的45%。作者还研究了这些化合物的光稳定性，当它们被调到最大吸光度的led照射时。作者发现，尽管IR-800CW和FNIR-866表现出类似的光稳定性，但在这些条件下，FNIR-1072只经历了最小程度的光漂白(<5%))。后面的观察结果与之前的研究一致，表明水环境中的花菁光漂白主要是通过自敏的1O2机制介导的，这可能不太容易接近FNIR-107239的低能三态。这一假设与FNIR-1072相对于FNIR-866和结构相关的七甲基花菁的单重态氧量子产率(ΦΔ)的降低是一致的40。作者还通过监测各自吸收最大值随时间推移的吸收来检查它们在血清中的化学稳定性，发现这些染料非常稳定，相对于IR-800CW 没有明显差异。
为了方便非甲基花菁和七甲基花菁的复合成像，作者开发了一个定制的成像系统33，包含三个不同的近红外激光激发源(λex)，三个染料各一个(七甲基花菁染料λex = 785 nm, FNIR-866 λex = 892 nm，苯并融合Cy9染料FNIR- 1072 λex = 968或1064 nm)，以及一个1300 nm的LED用于反射成像。作者使用了长通发射过滤器(指定的)，它可以检测这些染料的发射尾。当用它们各自的激光线在等功率密度(90 mW/cm2)激励并使用1,150 nm长通发射滤波器成像时，非甲胺菁染料的SWIR尾发射与商用七甲胺菁染料ICG、IR 800CW和作者优化的七甲胺菁单抗标签FNIR-Tag相比较，但略大于。利用每种染料的最佳激发波长，作者研究了使用等浓度染料溶液的每个通道中的重叠发射，发现在785-nm和890-nm通道中存在相当多的串扰。然而，通过对较低浓度的较长波长的染料成像，逐渐延长相机曝光时间或通过改变激发功率，可以实现高效的光谱分离。此外，这些染料可以通过传统的基于激发和发射波长的多路复用方法进行光谱分离，使用两个具有量子效率的传感器，覆盖近红外和SWIR。
考虑到这两种新的生物偶联染料与广泛使用的七聚氰胺(ICG和IR-800CW)的复合潜力，作者制备了相应的单抗FNIR-866和FNIR-1072与抗egfr单抗帕尼单抗的偶联物。作者发现第一代FNIR-866具有较差的标记效率(使用10 eq的NHS酯的标记度(DOL)为0.6)，并有证据表明在共轭过程中形成了h聚集。然后，作者通过添加一个附加磺酸基的连接子来制备染料FNIR-872，以改善相应抗体荧光团偶联物的标记和性能。
使用非甲胺菁单抗偶联物进行靶向成像。作者选择FNIR-872-Pan和FNIR-1072-Pan作为临床研究IR-800CW-panitumumab (IR-800CW-Pan)的基准43。每个偶联物(100 μg剂量;将IR-800CW的DOL为1.7,FNIR-872的DOL为1.4,FNIR-1072的DOL为1.0)注射到右侧皮下植入MDA-MB-468 (EGFR+)异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠(n = 3或4)尾静脉。所有三个偶联物都表现出相似的肿瘤靶向能力、TBR和生物分布，尽管FNIR-872和FNIR-1072的肝脏和背景信号较高，注射后7 d最终清除。此外，使用配备了近红外激光的标准epifluorescence显微镜在肿瘤组织中确认了IR - 800cm - pan和FNIR-872-Pan偶联物的摄取。突出这些探针的显著性能，作者还发现FNIR-872- pan可以用于清醒小鼠成像。这些结果表明，FNIR-872和FNIR-1072的缀合物可以以类似于现有的七甲川花菁染料的方式用于SWIR的体内成像实验。
通过使用纳米材料和高分子材料制备的小分子SWIR发射器，SWIR成像已被用于研究血液动力学和清除途径。右旋糖酐共轭物也广泛应用于此，并受益于明确的清除途径。因此，作者通过FNIR-872和FNIR-1072的偶联，以及作者优化的七甲基川菁染料FNIR-Tag41与生物兼容的分支多糖氨基葡聚糖制备了三种颜色的旋流发射血池制剂。在初始的双色实验中，作者在携带MDA-MB-468异种移植物的小鼠中注射有效的肾可清除的FNIR-Tag-Dex (10 kDa)，该小鼠于2天前给予FNIR-872- pan。使在体内和离体同时显示肾脏和肿瘤，并且最小限度地进行交叉对话。
有针对性的多色成像在短波-红外范围。ICG的优先摄取和保留已在许多实体肿瘤类型中得到验证。该方法在肝癌的背景下有广泛的临床验证;然而，使其应用复杂化的一个挑战是ICG的背景肝胆清除率与肿瘤信号的区分能力。作者假设，结合多色成像和SWIR检测可以帮助从周围健康肝组织无创性地勾画出ICG标记的肝脏深部肿瘤。单独使用单色近红外或SWIR成像，作者无法轻易地将肿瘤与周围肝脏组织区分开。相比之下，使用双色SWIR成像，作者可以很容易地在体内识别肝脏内的肿瘤，这可以很容易地通过坏死镜和体外成像得到确认。作者注意到，在本实验中，在ICG通道中观察到FNIR-872葡聚糖共轭物的显著发射，这可以很容易地在相应的合并图像中或通过光谱解混得到。
除了肿瘤质量靶向外，ICG还发现在基础和临床方面广泛应用于淋巴功能成像或前哨淋巴结可视化(例如，在癌症患者中)。在近红外检测中，由于缺乏与ICG不同的吸收/发射范围内的靶向方法，使用靶向小分子有机染料对肿瘤淋巴管和肿瘤肿块的同时无创可视化是不可能的。作者将ICG皮内注射到原位MDA-MD-468人乳腺肿瘤小鼠尾部，以便使用FNIR-872-Pan显示体内标记肿瘤附近的淋巴管。值得注意的是，在本实验中或在使用FNIR-1072-Pan作为肿瘤靶向剂的类似实验中，ICG和FNIR-872-Pan之间很少有交叉对话。此外，FNIR-1072- dex可与ICG和FNIR- 872-Pan联合使用，以突出肿瘤周围的血管，除了肿瘤可视化外，还可纵向评估血管通透性和淋巴泵。总之，这些实验说明了FNIR-872和FNIR-1072与ICG在高速多色体内成像实验中的效用。
为了使用户除了荧光之外还能看到解剖参考资料，作者加入了一个基于led的反射通道(1300 nm)，与荧光成像通道交错。作者还实现了一个用户友好的界面，允许所有四个通道实时可视化。这种方法也允许作者在实时多色引导下，使用FNIR-872或FNIR-1072交替作为血管或肿瘤靶向剂，对肿瘤和淋巴结进行精确的解剖。
讨论
在这里，作者报告了由邻苯二酚和芳基环融合到非甲基胺支架上的新型长波长发光荧光团的合理设计、合成和评估。这些研究表明，对核心花菁发色团单元进行合理设计的修饰可以显著改变其光学性质，当与合适的外围取代基结合时，可以保持较高的化学稳定性和优良的水溶性。胺反应的NHS酯能够制备高辐射的单抗和右旋糖酐生物缀合物，用于各种体内实验。作者证明了这些化合物可以与ICG和其他临床相关的七聚氰胺染料一起使用，在SWIR范围内的第一个双色和三色成像实验中，仅使用靶向小分子有机染料。重要的是，作者的成像方法对可见光不敏感，并允许在室内灯亮着的情况下进行荧光引导手术，前提是照明基于可见LED或其他非旋涡发射技术。这简化了目前的工作流程，可能需要调暗房间和手术照明，或将这些灯光同步到荧光成像系统控制的百叶窗上。除了在癌症研究中的应用，作者预计这种多色成像方法可以用于各种临床应用。例如，首先，需要切除肿瘤，其次，需要跟踪引流淋巴管以确定前哨淋巴结，最后，需要通过血池剂检测吻合口的灌注来检查其生存能力。现有的全磺化吲哚菁(“cy -染料”)是多路显微镜实验的首选荧光团。这些研究将这些分子的应用扩展到多色的活体成像和潜在的未来临床转化。在这里，作者已经证明了在小鼠模型中同时标记肿瘤肿块以及相关肿瘤血管和淋巴管的潜力。这些分子结合作者开发的多通道实时可视化工具，可以应用于需要多种信息的不同临床前和临床环境。关键的是，这些努力提供了相对于七甲川菁染料具有红移激发波长的生物共轭荧光团，并使在全身体的活体动物环境中进行一系列的多重生物研究成为可能。进一步优化这些高阴离子支架的物理性能可能会改善它们的体内性能。作者还设想，通过衍生化这些支架，可以获得动态的刺激响应探针。
参考文献
Targeted multicolor in vivo imaging over 1,000 nm enabled by nonamethine cyanines. Venu G. Bandi, Michael P. Luciano , Mara Saccomano, Nimit L. Patel, Thomas S. Bischo, Jakob G. P. Lingg, Peter T. Tsrunchev , Meredith N. Nix, Bastian Ruehle , Chelsea Sanders, Lisa Riffle, Christina M. Robinson, Simone Difilippantonio, Joseph D. Kalen , Ute Resch-Genger , Joseph Ivanic , Oliver T. Bruns and Martin J. Schnermann. Nature Methods volume 19, pages353–358 (2022).DOI: 10.1038/s41592-022-01394-6
