内容提要
近红外（NIR）荧光团在800 nm以外的区域（即深近红外光谱区域）吸收最大，是生物医学应用的积极寻求。理想的染料是明亮、无毒、可光的、生物相容的，并且易于衍生化以引入功能（例如，用于生物偶联或水溶性）。这种荧光基团的合理设计仍然是一个重大挑战。硅取代的罗丹明已成功用于红色光谱区域的生物成像应用。迄今为止，深近红外光谱区域的较长波长硅取代同族元素尚不清楚。作者成功制备了四种硅取代的双苯环化罗丹明染料（ESi5a-ESi5d），在克级上具有高效的五步级联。由于它们的HOMO-LUMO轨道的广泛重叠，ESi5a-ESi5d具有高度吸收性（λabs ≈ 865 nm and ε > 105 cm–1 M–1).通过通过环形限制旋转自由度和通过硅赋予应变的振动自由度，ESi5的荧光致变色支架具有高度刚性，从而具有异常长的荧光寿命 (τ > 700 ps in CH2Cl2)和高荧光量子产率（ϕ = 0.14 in CH2Cl2)。它们对光漂白的半衰期比当前标准（血清中的ICG）长2个数量级。它们在亲核试剂或活性氧的生物相关浓度存在下是稳定的。它们的毒性很小，容易代谢。在尾静脉注射ESi5a（作为一个例子）时，裸鼠的脉管系统成像具有高信噪比成像。ESi5染料在深近红外光谱区域的生物成像方面具有广泛的潜力。
结果和讨论
逆向合成分析表明，ESi5可能由7-氨基-2-溴萘衍生物制备，其顺序与较短波长的硅氧杂蒽染料的序列非常相似。虽然是商业的，但1很贵。幸运的是，7-羟基-2-溴萘可以批量供货，价格约为1美元/克。利用宝齐莱反应，将羟基转化为氨基，以提供1的高产率。作者打算通过在1-溴-3-氯丙烷中回流，将1进一步转化为其朱洛利定衍生物。令作者惊讶的是，2是以接近定量的产量获得的。在Friedel烷基化条件下进一步环合2的氯丙基没有成功。接下来，作者尝试从3合成ESi5染料，担心C-6的亲电芳族取代可能与C-3竞争，并且氯丙基可能对烷基/芳基锂或格氏试剂不稳定。事实证明，2不仅是制备ESi染料的合适前体，而且还引入了进一步衍生化的功能。化合物2在回流的MeCN中与(CH2O)n在BF3·OEt2存在下缩合，收率为29%。在−78°C的THF中，3的溴-锂交换产生所需的二锂物种(4)，与SiCl2Me2和SiCl2Ph2反应，然后分别氧化制备5和8。随后将芳基锂试剂（6a和6b）亲核添加到5和8的羰基中，然后脱水分别产生了良好的产率ESi5a-ESi5d。两个末端Cl原子可以被叠氮化物置换，以制备7，产率约为60%。通过点击平均分子量为1900 amu的末端炔烃改性聚乙二醇链（PEG-C≡C-H），得到ESi5b-PEG。
近红外染料的晶体结构是一种罕见的享受。作者成功地生长了ESi5b和ESi5d的晶体用于XRD分析。由于硅的原子半径比碳大，两个萘环之间的键角被拉伸到125°，导致筒仓-五苯核心略微弯曲。两个N原子与萘环具有良好的共面性。ESi5b和ESi5d都表现出C 2V固态对称。当向下观察其晶胞的b轴时，两个分子都堆积在J型柱中，相邻分子之间的距离约为3.54 Å。这些色谱柱堆叠在一起，ESi5b的间隔距离约为4.86 Å，ESi5d的间隔距离约为6.17 Å。ESi5b的所有分子在其固态下都朝同一方向前进。有趣的是，对于ESi5d，相邻层的分子彼此远离。
ESi5a−ESi5d在CH2Cl2、MeCN、MeOH、DMSO、AcOH、PhMe以及MeCN和H2O混合物7种不同溶剂中获得了紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。ESi5a和ESi5b的光谱相似，ESi5c和ESi5d的光谱相似。因此，ESi5a和ESi5c在CH2Cl2在图中作为代表。ESi5a、ESi5c在其他溶剂中的光谱以及ESi5b和ESi5d的光谱包含在支持信息中。ESi5a和ESi5c的吸收光谱是典型的1类对称聚甲菁染料，在862 nm处具有尖锐而强烈的吸收峰（ε = 1.98 ×105cm–1M–1）表示 ESi5a和868 nm（ε = 1.60 × 105厘米–1M–1）的ESi5c，以及约760nm处的较低强度肩峰。在约350-750nm的整个可见光范围内，ESi5a和ESi5c的吸收基本上可以忽略不计。可见的透明度对于体内应用是有利的，因为它不会导致手术区域变色。它们的吸收最大值在MeCN，MeOH，AcOH和PhMe中基本相同，并且在DMSO中红移约24 nm。ESi5b-PEG是高度水溶性的，其吸收光谱是在磷酸盐缓冲液中获得的，吸收最大值为878 nm。许多小分子NIR有机染料在水性介质中表现出对称性破坏。它们的水吸收光谱的特点是相对于主条带的肩峰大大增强，限制了它们的生物用途。作者以ESi5b为例研究了ESi染料的吸收光谱，其中DMF和PBS的比例不同。添加40%或更少量的PBS不会导致吸收光谱的任何变化。当PBS百分比在40%–90%以内时，878 nm处的吸收带表现出轻微的催眠色和低色素位移。当DMF的百分比变为低至5%时，878 nm处的该波段减小，约800 nm处的肩峰随着蓝移而增强。总之，这些结果表明，ESi5染料的光谱对水诱导的变化具有相当的抗性，除非在溶剂中它们变得完全不溶。当连接到PEG链上时，ESi5b-PEG变得水溶性，并在纯磷酸盐缓冲液中表现出类氰胺光谱。这证明了ESi5bPEG可以在ESi5a-d水溶性不够的纯水介质中使用。
紫外-可见吸收带的光谱宽度，特别是 S0→ S1吸收带，是结构刚度的指示。因此，当振动自由度受到较低温度或压力增加的限制时，观察到带宽减小。要计算FWHM，有必要对感兴趣的光谱进行去卷积（cm–1）到其构成的高斯形吸收带。对称和不对称菁型或类黄烷染料的理论研究表明，S0→ S1聚甲硫菁染料的吸收带通常由四个构成振动峰的振动峰组成，尽管这些峰的光物理起源仍然是理论和光物理研究的热门话题。在这项工作中，S的四个山峰S0→ S1波段也很容易在数学上识别，并分别以蓝色、黑色、红色和绿色进行颜色编码，按吸收波长的降序排列。综合摩尔吸收系数（ε′，cm–1M–1），用于计算其对整个光谱的贡献百分比。这些峰的宽度（FWHM，cm-1）是振动自由度的信息。对于具有对称推拉支架的发色团，通常发现一个小的FWHM，表现出低结构自由度，反之亦然。
作者首先选择去卷积紫外-可见吸收光谱（单位：cm–1）的 ESi5a，因为它的组成条带分离良好且易于识别。它拟合到多个构成高斯峰的数学模型中，即最长递减的a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7和a8。在700-950 nm的较长光谱区域中的峰值a1，a2，a3和a4可能来自ESi5a从最低振动水平S0的HOMO-LUMO跃迁到更高的振动水平 S1。峰a1、a2、a3和a4在867 nm处的比摩尔吸光度分别为1.97 × 105、1.93 × 104、3.27 × 104和4.57 × 103，在711 nm处的比摩尔吸光度为697 cm−1，分别为526cm−1，1038 cm−1, 1409cm−1。在350-700nm的较短波长区域，总共确定了另外四个波段，即a5，a6，a7和a8，可能是来自低洼被占领轨道到LUMO轨道的跃迁。a5、a6和a8这三个波段更清晰，a7特别宽。ESi5c在CH2Cl2中的吸收光谱也类似地反卷积到同一组构成峰。类似地，获得了ESi5a−ESi5d在其他溶剂中的反卷积光谱，并将其纳入支持信息中。
在光激发时，NIR荧光团很容易通过振动/旋转介导的非辐射途径经历失活。因此，它们通常表现出越来越低的荧光量子产率和相当短的荧光寿命。在CH2Cl2中测得的绝对荧光量子产率为ESi5a的0.12,ESi5b的0.11,ESi5c的0.14,ESi5d的0.15。它们是相应光谱区域中最亮的近红外染料之一，ε和φ的乘积高于∼2×104cm–1M–1.（4b）它们的量子产率在极性非质子溶剂中同样高，例如CH3CN和DMSO，在极性质子溶剂（例如MeOH和AcOH）中略微降低至<10%（参见支持信息中的图S3-S6和表S1-S4）。ESi5b-PEG在磷酸盐缓冲液中的荧光量子产率约为1.8%。这些染料的发射光谱可以拟合到一组两个高斯峰上。较窄峰（e1）的FWHM与峰a1的FWHM基本相同。这是一个非常有趣的观察结果，以前没有报道过，并表明它们具有相同的光物理过程。此外，较宽峰的FWHM与峰a3的FWHM基本相同。没有获得超过1300 nm的发射光谱的尾矿部分。尽管如此，峰值e2的尾部远远超过了1300纳米大关。出于这个原因，作者尝试使用截止波长为1350和1450nm的长通滤光片进行体内成像。这种非高峰活体成像已成为该领域的常规做法。
获得了ESi5a−ESi5d在不同有机溶剂中的荧光寿命。当追求高荧光亮度时，这是一个可行的参数来评估荧光团的优越性。通常，较长的荧光寿命的染料表明较少的竞争非辐射衰变途径。对于可见范围内的明亮染料，荧光寿命通常为几纳秒。随着光谱波长的红移，荧光寿命有望变短。不幸的是，只有很少的工作包括荧光寿命，部分原因是缺乏仪器来测量如此长的波长光谱区域。据报道，具有相似λabs/λem波长(862/ 883 nm)的Flav57j在CH2Cl2中表现出约300 ps的寿命，作者报道了ECX8h在CH2Cl2中表现出约700 ps的寿命。作者发现，在CH2Cl2中，ESi5a−ESi5d的荧光寿命为>760 ps。这有力地表明，它们是非常坚硬的染料，不像这些现有的近红外同源物那样容易腐烂。在CH3CN和DMSO中，它们的寿命下降到~ 500 ps，在MeOH和AcOH中，这些值进一步下降到~ 250 ps，这表明氢键可以促进激发态的快速衰变。PhMe的寿命也很短，只有~ 200 ps。
以ESi5染料ESi5b和ESi5d为代表，在CH3CN中利用瞬态吸收光谱对其激发态动力学进行了研究。在780 nm激发时，ESi5b和ESi5d分别在约430、505、620和710 nm可见范围内观测到了4个ESA波段，其中约505 nm处的ESA波段最强。此外，基态漂白(GSB)带在每个吸收最大值处都被观察到，但由于探测器的技术限制，超过850 nm的部分无法被检测到。提取每种染料的ESA/GSB带的动力学谱。推测每种染料的三种寿命(τ1、τ2和τ3)。据推测，τ1和τ2(分别<1 ps和~ 150 ps)可能归因于溶剂笼和振动介导的S1的最低振动态弛豫，τ3 (~ 550 ps)对应于发射态到基态的衰减，因为τ3与从TCSPC技术获得的荧光寿命值相吻合。支撑信息中包含了ESi5b和ESi5d在900 nm及以上光谱区域的瞬态吸收光谱，其中发现了它们的受激发射带。
与同光谱区域的其他近红外染料相比，ESi5a−ESi5d和ESi5b-PEG具有明显的吸收带、高抗水致对称性破坏、高荧光量子产率和长荧光寿命等特点。这些性质都是实验证明，它们具有较高的结构刚性，符合合理的分子设计原则。以ESi5b和ESi5d为例，利用密度泛函理论(DFT)定量评价了ESi5染料的振动自由度。基态(S0)结构优化在B3LYP-GD3BJ/6-311G(d) 32级，激发态(S1)结构优化在DFT-SMD (CH2Cl2)-CAM-B3LYP/6-311G(d)水平。计算不同正常模式下的重组能，以评估第一(S1)激发态荧光团通过非辐射衰变的可行性。与ESi5d相比，ESi5b具有更多的低频模式(<500 cm−1)，其中，这些峰值的强度被积分为280 cm−1。进一步分析发现，ESi5b的SiMe2结构柔韧性与9、18、38、77、81、118和144cm-1这几个最高强度模态有关。。当ESi5b的两个甲基被在ESi5d中发现的更重的苯基取代时，结构灵活性受到抑制，500 cm−1以下正模的总重组能为76 cm−1，表明振动自由度显著降低。
除了近红外荧光团的亮度，它在生物环境中的稳定性是另一个至关重要的性质。现有的近红外染料很容易通过光异构化和光漂白进行光漂白。使用自制的808 nm激光荧光显微镜，作者测试了ESi5b/ESi5d/ESi5b- PEG(在含有5% DMSO和5%血清的PBS中)的光稳定性。将这些染料的溶液逐滴沉积在载玻片上，并用盖片密封。用808 nm激光线以3.16W/cm2的功率照射这些载玻片。图像采集是间断的。在此条件下，ICG的荧光强度在10 s内消失，漂白半衰期仅为2.1 s。ESi5b和ESi5bPEG的半衰期分别降低约30%，分别为63和64 s。ESi5d的半衰期明显长于ESi5b/ESi5b-PEG，因为在300 s内发射强度保持稳定。趋势是ESi5比ICG表现出更高的抗光漂白能力。此外，在ESi5系列中，二苯基硅基化合物(ESi5c/ESi5d)的光稳定性明显高于二甲基硅基化合物(ESi5a/ESi5b)。与PEG衍生化后光稳定性略有改善。与单取代类似物(ESi5a/ESi5c)相比，底部苯环的邻位二取代(ESi5b/ESi5d)略微降低了光稳定性。
研究了ESi5a−ESi5d对普遍存在的生物亲核试剂的化学稳定性。氢氧根和硫醇通过迈克尔型途径可逆地加入推拉支架。ONOO−的攻击可能会导致推拉式支架的氧化裂解，可能是通过拜耳- Villiger机制。ESi5染料的双苯并杂蒽核具有良好的抗亲核性，因为只有一个位点易发生亲核攻击(即中央甲基碳)。同时保护花菁染料的所有亲电碳中心是困难的，而ESi5的中心甲基碳通过底部苯基的正交取代很容易被屏蔽。例如，在CH3CN/H2O中的ESi5a−ESi5d溶液(v:v = 1:1)中加入生物亲核试剂(如HS−、半胱氨酸和谷胱甘肽)并孵育300 s。可以总结出以下几个趋势。首先，具有较小空间位阻和较高酸度的硫醇(即H2S)对ESi5染料的中心甲基碳表现出较高的反应活性。其次，底苯环单邻位取代的ESi5a/ESi5c易发生亲核攻击，通过双邻位取代可以有效抑制这种反应，例如ESi5b/ESi5d。染料对氧化物质的反应性可能由两种不同的机制介导。例如，H2O2、HOCl和HOONO是亲电试剂，可能与染料推拉系统的亲核位点发生反应。此外，它们可能以共轭碱的形式存在，这些共轭碱是亲核的，可以攻击中心的甲基碳。H2O2对ESi5a-d不反应，测试高达2 mM。令人高兴的是，添加HOCl/ClO−(最多100μM)并没有导致溶液吸光度的明显下降。过氧亚硝酸盐的pKa值为6.836，主要以阴离子形式存在于中性水介质中。ONOO−是一种有效的α效应亲核试剂，大量过量添加时可漂白ESi5a−ESi5d染料。然而，由于ONOO−生理水平的增加(低于μM)导致的ESi5a−ESi5d的降低可以忽略不计。
包括急性毒性和代谢率在内的生物相容性是控制其实际应用潜力的其他特性。ESi5a及其水溶性类似物（ESi5b-PEG）被选为该系列NIR染料的代表。首先，在ICR小鼠中测定ESi5a的LD50为18.5 mg/kg，这已经是100μg/kg时ESi5a工作浓度的200倍，用于体内成像。其次，ESi5a在人和小鼠肝微粒体中的代谢半衰期测量为约25.5分钟，比ICG的生物学半衰期（约2-4分钟）长约10倍。第三，ESi5a的毒性及其生物循环时间可以通过明智的衍生化轻松微调。例如，测试高达200mg / kg的ESi5b-PEG很容易被ICR小鼠耐受，而不会表现出明显的毒性或导致死亡。
由于ESi染料的高亮度，高稳定性和低毒性，作者测试了它们在小动物生物成像中的潜力。涉及NIR染料的两种最流行的成像方式是NIR-II荧光成像和光声成像。
ESi5染料在体内成像中的潜力得到了例证，以ESi5a为例。在裸鼠中，通过尾静脉注射含有5%DMSO的PBS中的ESi5a（100μg/ kg）溶液，然后通过面罩吸入异氟醚来维持麻醉。注射后3分钟拍摄整个身体的第一张快照，激光线为808nm，长通发射滤光片为1000nm，曝光时间为1ms。此时，观察到肠道上方的小鼠身体部分。肝脏、脾脏和心脏等器官以及主要血管清晰可见。肝脏左侧的一小块区域特别明亮。计算腹部区域血管的信噪比（SBR）为1.15。
在7 ' 46″注射后，拍摄了第二张快照，长镜头1100 nm，曝光时间5 ms。观察到SBR的改善，因为较长的波长发射较少被组织散射。在注射后9 ' 4″，14 ' 59″和18 ' 11″，分别以1250,1350和1450 nm的长通道拍摄了另外三个快照。散射变得不那么明显，随着收集到的发射波长变长，SBR继续改善，因此需要更长的曝光时间，因为收集到的光更少。到9’4″时，肝脏左侧的明亮信号基本减弱，胸椎变得明显。另外，有趣的是，肝脏有一个非常明亮的区域。利用这些成像数据结果，可以在SBR和长通发射滤波器在约1200 - 1350 nm的时间分辨率之间取得平衡。
左后肢血管经1250和1350 nm长通道成像。两幅图像的信息基本相同，可以清楚地显示出微血管，以及一些小血管。然而，通过使用1350nm长通滤波器，背景信号显著降低，从而更准确地测定血管。
此外，在裸鼠头皮切除后，使用具有NIR-II能力的广角显微镜对裸鼠的脑血管网络进行成像。1250nm长通滤波器显示，大脑上区域的血管网络包括上矢状窦、横窦和连接上矢状窦的浅静脉。由于1250nm长通滤波器的散射，大脑的小脑部分不可见，当切换到1350nm长通滤波器时清晰可见。放大后可以提供更多细节和更高的空间分辨率。
高水溶性的ESi5b-PEG也可用于体内成像。它实际上表现出比ESi5a更长的血液循环时间，这是通过监测来自血管的荧光强度减少的速度来定性判断的，这对生物应用来说是一个优点。
测试了ESi5染料用于光声成像的可行性。按照文献步骤制备组织影。将DMSO中的ESi5a原液稀释到含30% CH3CN的PBS溶液(pH 7.4)中，密封在直径为3毫米的吸管中，放置在模型内。然后在H2O设置下进行测量并重建图像。使用相同大小的roi分析数据。
显然，光声信号的整体趋势与吸收光谱很好地吻合，最大值在约870 nm处，肩峰在780 nm处。780 nm和870 nm之间的光声信号比没有吸收光谱中发现的光声信号大。值得注意的是，在前50个循环内，光声信号的漂白相对于辐照重复而言是可以忽略不计的。
然后将4T1乳腺癌细胞移植到BALB/c小鼠，并让肿瘤生长4周。作者在肿瘤中注射了同样的ESi5a。小鼠放置在多光谱光声断层扫描成像系统(MSOT)中。每次扫描前，让动物的体温在水箱中保持平衡10分钟。注射前进行背景扫描。将ESi5a (100 μL, 100 μM)溶液注入肿瘤。让小鼠恢复30分钟，然后再次扫描。扫描是在H2O设置下进行的，使用先前拍摄的幻影光声光谱进行重建和光谱分离。为了进行分析，将注射后肿瘤内光声信号最高的位置与注射前扫描中肿瘤内类似的位置进行比较。分析结果显示光声信号增强约2倍。作为概念验证实验，建立了ESi5a光声成像的潜力。
结论
总之，Xiao, Qian和他们的同事在2008年首次通过用二甲基硅基取代罗丹明核心的桥接O原子制备了硅-罗丹明。这种修饰导致了吸收和发射波长的大的基色偏移，提高了光稳定性，硅罗丹明染料从此成为红光谱区域(即640 nm)的所有应用的最爱。硅罗丹明的成功无疑促使该领域制备苯环类似物，然而，其合成并不明显。作者最终解决了这个挑战。成功合成双苯环化(ESi5a−ESi5d)硅取代罗丹明染料的关键是不可能没有作者偶然合成的前体(1)。作者能够生长ESi5b和ESi5d的x射线质量晶体，以揭示它们在固态下的结构细节和堆积模式。在CH2Cl2中，ESi5a−ESi5d的吸收和发射波长约为860/900 nm。由于ESi5a−ESi5d的对称性质，它们的吸收和发射带都很清晰，并具有良好的镜像关系。ESi5a−ESi5d的摩尔吸收系数为>105 cm−1 M−1，是典型的对称推拉型聚甲基甲烷染料。值得注意的是，由于它们具有较高的结构刚度和较长的荧光寿命，它们对CH2Cl2中深近红外光谱区域的染料均表现出优异的荧光量子产率，即ESi5a−ESi5d分别为0.12/0.11/ 0.14/0.15。此外，与相同光谱区域的近红外染料(如ICG和NP)相比，这些染料表现出更高的抗光漂白性能。它们还表现出对半胱氨酸和谷胱甘肽生理浓度的亲核攻击的高抗性。不容易被H2O2(最大2 mM)和HOCl(最大100 μM)氧化。与ESi5b和ESi5d相比，底部苯环上有一个邻甲基的ESi5a和ESi5c在HS−和ONOO−的亲核攻击中受到的立体保护较小。以ESi5b (LD50 = 18.6 mg/kg)和ESi5b- PEG为例进行急性毒性试验。ESi5b-PEG毒性最小，经测试可耐受200 mg。尾静脉注射ESi5a可用于小鼠脉管系统的绘制。利用小动物荧光成像系统，可以对小鼠全身成像，显示荧光强度的时空变化，反映ESi5a在体内的循环传递和分布。作者进一步证明，更长的波长1350 nm的截止发射滤波器是减少光散射和提高所得到的荧光图像的信噪比的首选。使用立体显微成像系统，可以看到更细的结构，包括直径约30μm的微型脑血管。这些染料在光声成像和荧光成像等近红外成像领域具有广阔的应用前景。作者期待这种合成方法能对合成染料的化学家产生启发，并期望ESi染料在材料、生物、转化和最终临床研究中得到广泛应用
参考文献
Stable, Bright, and Long-Fluorescence-Lifetime Dyes for Deep-Near-Infrared Bioimaging. Jin Li, Yan Dong, Ruwei Wei, Guanyu Jiang, Cheng Yao, Meng Lv, Yuyang Wu, Sarah H. Gardner, Feng Zhang, Melissa Y. Lucero, Jian Huang, Hao Chen, Guangbo Ge, Jefferson Chan, Jinquan Chen, Haitao Sun, Xiao Luo, Xuhong Qian, and Youjun Yang*. J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 31, 14351–14362.https://doi.org/10.1021/jacs.2c05826
