内容摘要
棕色脂肪（BAT）在肥胖等代谢疾病的治疗中有着广阔的应用前景，但迄今为止的研究一直依赖葡萄糖类似物[18F]-脱氧葡萄糖（[18F]-FDG）作为示踪剂的PET成像，该成像方法的局限性促使了人们对新型BAT功能探针与多模态成像技术的迫切需求。共轭聚合物纳米探针（Pdots）在棕色脂肪成像中具有显著优势，在无需提前进行冷刺激的情况下即可对BAT进行快速成像。然而目前其成像机制仍不明确，为此，在本文中作者继续对Pdots成像BAT机制进行了深入研究，发现亲脂性的Pdots可对富含甘油三酯的脂蛋白（TRLs）产生高亲和力，并通过与TRLs的结合被BAT毛细血管内皮细胞特异性摄取。相较于半衰期较短的PSMA修饰的Pdots（PSMAC-Pdots），以及脂溶性较低的聚乙二醇（PEG）修饰的Pdots（PEG-Pdots），具有良好脂溶性及适宜半衰期的无配体修饰的Pdots（Naked-Pdpts），在尾静脉注射5分钟后在毛细血管内皮细胞的摄取率可高达94%。急性冷刺激后其摄取率迅速增加，通过Pdots的摄取变化可以灵敏地反映棕色脂肪活性变化。基于此，作者进一步开发了一种利用多模态Pdots在体检测BAT活性及TRLs摄取的新策略。
结果与讨论
为了验证亲脂性Pdots通过与TRLs结合并在其介导下在BAT中积累这一假设，作者首先通过纳米“共沉淀法”制备了亲脂性不同的三种Pdots。naked-Pdots由亲脂性共轭聚合物MEH-PPV和近红外小分子染料NIR775所组成。其中MEH-PPV作为荧光共振能量转移（FRET）的供体，近红外染料NIR775作为FRET的受体可以将波长红移到近红外区。相较于naked-Pdots，PEG-Pdots和PSMAC-Pdots的外层分别用两亲聚合物PS-PEG-COOH和PSMAC进行包覆以降低其亲脂性。合成的PEG-Pdots和PSMAC-Pdots表面均具有羧基官能团，同时PEG-Pdots外层还含有PEG长链。
PEG-Pdots和naked-Pdots水合粒径约为65nm，PSMAC-Pdots的粒径约为31nm。三种Pdots的Zeta电位均低于-20mV，PDI均小于0.2，说明具有良好的胶体稳定性和分散性。紫外光谱表征结果显示纳米探针中MEH-PPV及NIR775的最大吸收峰分别位于500nm及772nm处，在808nm激光的激发下，NIR775在1000nm处有最大发射特征峰。进一步在小鼠体内测定了3种Pdots的半衰期，PEG-Pdots、naked-Pdots和PSMAC-Pdots的血液半衰期分别约为5小时、42分钟和7分钟，通过PS-PEG-COOH的包覆可以有效延长PEG-Pdots的血液循环时间，而PSMAC-Pdots则会迅速被机体所清除。接着，在37℃的条件下分别将Pdots分散在PBS，DMEM和HEPEs溶液中测定其物理稳定性。在24小时内，Pdots的粒径均在一定范围内波动，同时在PBS和HEPEs中其荧光强度没有发生明显变化，在DMEM中荧光强度增加了约40%。稳定性实验结果说明纳米粒子有较好的粒径稳定性和荧光稳定性。
接下来，作者利用所合成的三种Pdots在活体水平上进行假设的验证。BAT的内部具有丰富的毛细血管网络结构，并且管壁致密不具有渗透性。为了保护机体抵御寒冷产生热量，BAT会“燃烧”大量TRLs水解得到的脂肪酸。血液中的TRLs会首先在毛细血管腔表面停留，继而在脂蛋白脂酶（LPL）的作用下进行水解。当TRLs的尺寸缩小到一定程度后以CD36依赖的方式被毛细血管内皮细胞内化，并最终进入到细胞内的胞内体/溶酶体中。在短期冷暴露的条件下，TRLs在BAT中的内化增加。经过肝素处理后，由于外源性肝素会破坏毛细血管内皮表面GPIHBP/LPL的复合结构，从而导致TRLs在BAT中的摄取减少。若在不同生理条件下Pdots与TRLs在BAT毛细血管累积变化具有一致性即可证明“Pdots在血液中与TRLs相结合，并在TRLs的引导下进入BAT毛细血管内皮细胞”这一假设。
空白小鼠肩胛间棕色脂肪（iBAT）的平均荧光强度([p/s/cm2/sr]/[μW/cm2])为2.7×107。尾静脉注射PEG-Pdots和naked-Pdots后正常小鼠iBAT的平均荧光强度分别增加至1.1×108和9.0×107。相较于正常小鼠，经肝素处理的小鼠注射两种Pdots后iBAT的荧光强度明显降低，而经过冷处理的小鼠（4℃，1.5h）其荧光强度显著增加。这些结果与经肝素预处理及急性冷处理后TRLs在iBAT的摄取变化一致。由于PSMAC-Pdots的血液半衰期较短（t1/2=7分钟）易被网状内皮系统（RES）吞噬清除，因此PSMAC-Pdots没有在正常小鼠和冷处理小鼠的iBAT中选择性地积累。对离体信号进行分析发现，iBAT的离体信号变化与活体成像一致。为进一步观察Pdots在iBAT中的具体分布情况，利用CD31进行免疫荧光染色定位Pdots与毛细血管之间的位置关系。CD31染色有阳性信号的血管平均直径约为4.38μm，证实其为毛细血管。在正常小鼠和冷处理小鼠的iBAT中PEG-Pdots和naked-Pdots信号与CD31信号相重叠，并且冷处理小鼠中的信号比正常小鼠的信号更强。而在肝素处理的小鼠和注射PSMAC-Pdots的小鼠中则几乎没有检测到荧光信号。结合上述结果可以初步验证“Pdots通过TRLs的介导被内皮细胞摄取从而对iBAT毛细血管成像”这一假设。
在尾静脉注射Pdots 5分钟，30分钟和1小时后，分别对小鼠进行心脏灌注去除血液中流动的Pdots，此时iBAT冰冻切片中的荧光信号则初步认为是毛细血管内皮细胞中摄取的Pdots荧光信号。由于CD36、LPL和GPIHBP1在毛细血管内皮细胞中高表达，在大血管中低表达或不表达，因此Pdots信号并未在直径约115μm的大血管中检测出来（白色虚线）。并且除肝脏和脾脏外，在其他器官均未检测出Pdots的荧光信号。进一步将iBAT消化离心，Pdots的荧光信号也未出现在上层漂浮低密度棕色脂肪细胞中，这说明Pdots在注射1小时内并没有进入到棕色脂肪细胞中。以上结果说明Pdots在iBAT毛细血管中的摄取具有一定的特异性。
接着，对Pdots在BAT毛细血管内皮细胞中的摄取进行量化，通过流式筛选出BAT毛细血管内皮细胞（CD31+CD36+），并检测Pdots在其中的摄取率（Pdots+/CD31+CD36+）。由于PSMAC-Pdots的半衰期较短，灌注后在毛细血管中未检测出信号，其摄取率仅为1.5%。注射PEG-Pdots 5分钟后在冰冻切片中也几乎观察不到荧光信号，此时摄取率仅为3.0%，这说明5分钟时PEG-Pdots几乎没有被内皮细胞摄取。因此，作者认为IVIS成像中PEG-Pdots在iBAT 5分钟时的荧光信号来自Pdots在血液中的流动。虽然PEG-Pdots较长的血液循环时间增加了它们与TRLs结合的可能，但暴露在外层的亲水性结构起到了阻碍的作用。PEG-Pdots的荧光信号在注射30分钟和1小时后仅比5分钟略有增加，摄取率分别为11.1%和5.1%。相比之下，naked-Pdots具有较强的亲脂性，更易与TRLs在血液中快速结合进入毛细血管内皮细胞中。注射5分钟后naked-Pdots的摄取率可高达94.0%。1小时后仍保留较强的荧光信号，摄取率约为60%。因此，合适的半衰期和亲脂性是Pdots与TRLs结合并对iBAT毛细管成像的先决条件。此外，急性冷刺激后，毛细血管内皮细胞对naked-Pdots的摄取在5分钟内显著增加，利用Pdots成像特点可以对iBAT活性进行快速成像分析。因此，naked-Pdots可以作为一种用于检测iBAT活性的灵敏探针。
基于对成像机制的理解，作者进一步对Pdots进行开发并用于BAT的多模态成像。由于掺杂了NIR775，Pdots在808nm激光的激发下在NIR-II区窗口显示出了较强的荧光信号。尾静脉注射5分钟后肩胛部位的三角形脂肪组织区域（iBAT部位）即出现强烈的荧光信号。对成像数据进行ROI分析：注射探针5分钟，30分钟和1小时时，iBAT区域与背景的信号比均超过11，iBAT与肝脏的信号比分别为1.16、1.02和0.92。由于Pdots是通过TRLs的引导在棕色脂肪积累，因此Pdots还可以反映TRLs在体内的运输和储存情况。通过对小鼠连续7天腹腔注射β3-AR激动剂CL316，243(CL)，构建了一种BAT长期诱导激活的小鼠模型。BAT长期诱导激活会导致小鼠血液中的TRLs含量降低并形成富含ApoE的胆固醇的残余物，该残余物通过ApoE与肝细胞表面低密度脂蛋白（LDL）受体的相互作用被肝细胞吸收。与正常小鼠相比，由于CL给药小鼠血液中TRLs的含量降低导致Pdots与其结合下降，因此iBAT的荧光强度随之降低，更多的Pdots随着残余物颗粒进入至肝脏中。故此，Pdots可以取代传统放射性标记的策略，成为一种安全、快速、高灵敏度的TRLs检测探针。此外，尽管长期激活导致腹股沟处白色脂肪发生了褐变，但由于血液中与Pdots结合的TRLs含量下降，CL给药小鼠腹股沟处白色脂肪荧光强度仅略有增加，与正常小鼠无显著性变化。
由于掺杂了NIR775，Pdots在770nm处具有强吸收，同时光声图像显示随着Pdots浓度的增加其光声强度随之增加，显示出作为光声成像造影剂的潜力。注射Pdots进入小鼠体内后，在小鼠颈胸段的横断面图像中可以观察到明显的Pdots光声信号（绿色）。3D重建后，Pdots的光声信号分布于小鼠肩胛部位的三角形脂肪组织区域（iBAT区域）中。注射5分钟及30分钟后Pdots在iBAT处的信号强度从0.15±0.01分别增加至1.34±0.11（P<0.0001）及1.07±0.14（P<0.0005），显著提高了iBAT在光声成像中的对比度。此外，利用光声成像还可以检测iBAT中内源性物质，如含氧血红蛋白(HbO2)和脱氧血红蛋白(Hb)的水平变化。由于冷激活会导致iBAT血流量的增加，因此冷激活后小鼠iBAT区域HbO2的光声信号强度从0.61±0.04显著增至0.65±0.04（P<0.05），Hb光声信号从0.45±0.01显著增至0.53±0.01（P<0.0001）。接着，作者利用光声成像穿透深度深的特点观察了Pdots在体内的代谢情况，注射30分钟后Pdots主要代谢到了脾脏和肝脏中。综上，利用光声成像技术，不仅可以得到棕色脂肪的形态学信息，还可以检测出棕色脂肪在不同生理状态下的代谢变化。同时相较于内源性造影剂，借助外源性探针Pdots可以得到更高的组织对比度和更清晰的组织轮廓。
Gd(III)螯合物是临床常用的T1加权磁共振成像造影剂，作者进一步通过纳米“共沉淀法”将DTPA-BSA(Gd)掺杂至Pdots中进行BAT的磁共振成像。制备得到的Gd-dopedPdots弛豫率为14.744mM−1s-1，高于FDA批准的T1造影剂Magenvist的弛豫率（4.29mM−1s-1）。MRI成像结果显示注射Gd-doped Pdots 5分钟和30分钟后，iBAT区域与背景的信号比分别从4.48增加至7.30和9.78。同时，iBAT区域与周围肌肉的信号比在横切面和冠状面中均有不同程度的增加，说明注射探针使iBAT的T1加权成像具有更高的对比度。
结合uDISCO透明化技术，光片显微镜可在几分钟的时间内对大组织进行微米级分辨率的三维成像，可以避免大量的切片操作同时不引入伪影。根据作者之前的报道，PFBT-Pdots具有更高的量子产率，应用于透明化光片成像可以获得更好的成像效果。因此，作者选择PFBT-Pdots对iBAT的精细结构进行成像。肩胛间棕色脂肪的外层包裹着一层白色脂肪组织（iWAT），PFBT-Pdots的荧光信号出现在iWAT内直径约为30μm的血管中。由于iBAT高度血管化，Pdots在iBAT中的荧光信号分布非常密集，饱和的荧光信号将iBAT与周围iWAT形成强烈对比从而将两者的位置区分开。同时，可以清楚地观察到iBAT内部暗区直径约为53μm的大血管以及圆形的棕色脂肪细胞在其中紧密堆积。对图中棕色脂肪和白色脂肪细胞的直径进行测量，发现棕色脂肪细胞直径约为5μm，明显小于白色脂肪细胞的直径（39μm）。因此，注射PFBT-Pdots后对iBAT透明化处理并进行光片成像，可以在细胞水平上清楚地观察到iBAT的血管和脂肪细胞形态结构方法方便快捷，不需要使用转基因小鼠或免疫荧光染色操作，同时还避免了疏水性组织透明化技术中经常出现的荧光淬灭现象。
结论
Pdots通过与TRLs结合被BAT毛细血管内皮细胞摄取，实现了对BAT的毛细血管的选择性地快速成像。但是，Pdots必须满足适宜的亲脂性和半衰期这两个先决条件才能被毛细管内皮细胞快速大量摄取应。比如，PSMAC-Pdots的半衰期较短，PEG-Pdots的亲水性较强，都导致它们在毛细血管内皮细胞中的摄取率较低。而naked-Pdots具有良好的亲脂性和约30分钟的半衰期，在注射后5分钟摄取率即高达94%，1小时仍能维持60%。此外，当BAT被急性冷刺激激活后，naked-Pdots的摄取率显著增加。这种激活前后灵敏的成像变化使naked-Pdots可用于iBAT的活性检测。基于机制的研究，作者继而利用Pdots开发了一种针对BAT毛细血管的多模态成像策略。通过掺杂NIR775和DTPA-BSA（Gd），对BAT进行近红外二区、光声、磁共振成像。在功能性Pdots的作用下不仅可以将棕色脂肪与周围的软组织明显区分开，还可以监测其代谢活动。此外，作者还对BAT进行了透明化光片成像，在细胞水平上对BAT进行了三维观察和分析。作者认为结合多模态成像技术，未来Pdots将在肥胖、代谢综合征、线粒体疾病、脂质代谢紊乱等iBAT相关疾病的监测中具有更广泛的应用前景。
参考文献
Triglyceride-Rich Lipoprotein-Mediated Polymer Dots for Multimodal Imaging Interscapular Brown Adipose Tissue Capillaries. Jingru Li, Yixiao Guo, Panting Ren, Yufan Zhang, Ruijun Han, Liqin Xiong. ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 28981−28992. DOI: https://doi.org/10.1021/acsami.3c04525.
