内容摘要
七甲川菁染料可在近红外(NIR)窗口中实现深层组织荧光成像。基准染料ZW800-1的小分子偶联物已在人体中进行了测试。然而，使用ZW800-1偶联物的长期成像方案受到其不稳定性的限制，主要是因为化学不稳定的C4'-O-芳基接头容易被生物亲核试剂裂解。在这里，作者报告了一种模块化合成方法，该方法可生产新型双重束缚的两性离子七甲川菁染料，包括ZW800-1的结构类似物，具有大大增强的染料稳定性。这些双带染料的NIR-I和NIR-II版本可以与蛋白质（包括单克隆抗体）结合，而不会导致不需要的荧光团降解或染料在蛋白质表面堆积。荧光抗体偶联物在异种移植小鼠肿瘤模型中显示出出色的肿瘤靶向特异性。双束缚分子设计提供的增强稳定性将使新类别的体内NIR荧光成像实验成为可能，并可能转化为人类。
结果与讨论
dsZW800-1的合成。关键的合成中间体是无束缚染料3，它是在温和条件下通过用苯酚2取代前体1中的4’氯原子组装而成的，苯酚2的结构带有两个含有末端叠氮基的附加臂。随后的皂化反应将3转化为未束缚的染料4，随后进行铜催化的叠氮化物-炔环加成反应，共价连接两个侧翼带，生成 dsZW800-1，产率62%。
所有化合物的分子结构均通过标准光谱法进行了表征。包含ZW800-1、未束缚染料4和双束缚dsZW800-1在DMSO-d6中的1 H NMR光谱比较。ZW800-1和未束缚染料4的化学位移非常匹配，表明相似的分子构象。相比之下，dsZW800-1的光谱包括聚次甲基质子的特定上场化学位移，表明通过作为两个侧翼带一部分的三唑环的空间磁屏蔽。当获得dsZW800-1的X射线晶体结构时，获得了对这种分子内屏蔽效应的支持。dsZW800-1的晶体结构揭示了与NMR数据一致的其他几个结构特征。值得注意的是，嵌入的七甲川荧光染料采用预期的低能量、全反式构象，聚次甲基单元的C-C键长变化相对较小（即键长变化很小），反映了高水平的π-整个多烯的电子离域。与文献中具有4'-苯氧基取代基的无带七甲川染料的晶体结构的比较揭示了dsZW800-1中两个侧带带引起的两个独特的结构特征。一个特征是4'-苯氧基环相对于七甲川荧光染料的方向。通常，4'-苯氧基环的纵轴远离七甲川的垂直平面，但在dsZW800-1的情况下，4'-苯氧基环被侧翼带迫使与垂直七甲川对齐平面并将其面旋转至染料的一端。结晶dsZW800-1的另一个独特特征是分子内晶格堆积距离。通常，七甲川染料表现出聚七甲川荧光染料的滑移共面堆积和典型的3.5–5.0 Å的分子间距离。但在dsZW800-1的情况下，侧翼带强制每个分子的空间隔离，并且相邻荧光染料之间的分子间固态距离为9 Å。因此，即使dsZW800-1的多个拷贝在自聚集条件下被迫聚集在一起，侧翼带也能确保足够的空间分离，以防止染料跃迁偶极子的强烈耦合。
dsZW800-1的光谱特性和稳定性
染料光物理性质的比较表明，与ZW800-1相比，dsZW800-1中的两个侧翼带没有显着改变最大吸收和发射波长或荧光峰宽度。有趣的是，dsZW800-1在PBS中的荧光量子产率(11.0%)明显高于形式上为结构异构体的无束缚4的值(8.1%)。这种差异表明dsZW800-1中的受限侧带在抑制从染料激发态到周围水合壳的非辐射能量转移方面更有效，这通常是水中高度共轭 NIR 染料的主要能量弛豫途径。
ZW800-1、4和dsZW800-1的光稳定性通过进行简单的光漂白实验进行量化，该实验使用带有620 nm长通滤光片的氙灯照射PBS中的单独染料溶液，并将漂白曲线拟合为单相指数衰变。光稳定性测定顺序为4>dsZW800-1>ZW800-1。七甲川花菁染料的主要光漂白途径是光生单线态氧与聚次甲基荧光团的双分子反应，然后是键断裂和非荧光羰基片段的形成。ZW800-1相对较差的光稳定性与亲电子单线态氧与具有给电子4'-苯氧基取代基的七甲川的高反应性一致。4和dsZW800-1相对增强的光稳定性归因于近端线性臂或带提供的空间屏蔽，这可能会降低氧光敏化的效率和/或抑制随后与单线态氧的双分子反应。
通过一组光谱实验评估每种染料的化学稳定性，这些实验将染料与1 mM谷胱甘肽(GSH)混合在pH 7.4 PBS缓冲液中的单独溶液孵育。GSH中的亲核硫醇取代七甲川4-苯氧基很容易追踪，因为该反应会在七次甲基吸光度中产生明显的红移。GSH与ZW800-1反应的化学产物，经NMR和质谱证实。图中比较了三种染料在pH 7.4 PBS缓冲液和1 mM GSH中的稳定性曲线。未束缚的染料ZW800-1和4被快速完全消耗，半衰期(t1/2)分别为7.1和27分钟。形成鲜明对比的是，dsZW800-1与1 mM GSH孵育10小时后吸收光谱没有变化，表明没有反应（通过质谱法确认）。由于某些细胞内的谷胱甘肽水平可以达到10 mM将第二个dsZW800-1样品与10 mM GSH一起孵育10小时，仍然没有任何dsZW800-1降解的迹象。对GSH攻击的保护有力地证明了dsZW800-1中两个侧翼带的有效性，可以完全阻止生物亲核试剂取代不稳定的七甲亚胺4'苯氧基。
使用dsZW800-1进行抗体标记。由GSH引起的染料降解表明未带链的 ZW800-1和4不是蛋白质标记的好选择，因为不稳定的七甲川4'-苯氧基接头会随着时间的推移被蛋白质表面的亲核侧链切割，例如ɛ-表面赖氨酸残基的氨基。评估ZW800-1和dsZW800-1对蛋白质缀合的适用性的实验证实了这一预测。使用标准酰胺键形成化学将ZW800-1或dsZW800-1连接到山羊IgG抗体或牛血清白蛋白(BSA)。纯化的生物结合物的吸收光谱和荧光光谱。简而言之，与ZW800-1的蛋白质缀合相比，与dsZW8001的蛋白质缀合产生更高的标记度(DOL)，并且用dsZW800-1标记的蛋白质的荧光强度高3-4倍。着眼于IgG偶联物的稳定性，观察到IgG-dsZW800-1的NIR信号比IgG-ZW800-1稳定得多，正如跟踪PBS或血清。IgG-ZW800-1的已知化学降解是一个重大的技术限制，并且IgG-dsZW800-1大大增强的稳定性非常受欢迎。dsZW800-1作为稳定的NIR荧光标记特别有用，可用于测量植入染料标记细胞或生物材料的降解或运输的纵向实验。
使用dsZW800-1进行体内成像
dsZW800-1标记抗体的体内成像性能通过将dsZW800-1附加到帕尼单抗(Pan)上进行评估，帕尼单抗是一种靶向EGFR阳性肿瘤的临床单克隆抗体。Pan的荧光版本非常需要作为病理学和临床程序（如荧光引导手术）的癌症显像剂；然而，众所周知，泛染料偶联物的体内成像性能在很大程度上取决于附加染料的结构。在这方面，值得注意的是，图中Pan-dsZW800-1 (DOL=3.1)的吸收光谱在772 nm处表现出相对较窄的峰，其激发产生与游离染料相同的荧光光谱。没有证据表明抗体表面上的相邻附加dsZW800-1染料的H堆积对应的蓝移吸收峰是不希望出现的，因为染料H堆积会淬灭染料荧光并可能改变抗体的生物分布。此外，PandsZW800-1的吸收光谱在4°C下放置15天后没有变化，表明它的储存寿命与临床使用的重构Pan非常相似。通过将Pan-dsZW800-1静脉注射到EGFR+ JIMT-1（三阴性乳腺癌）荷瘤小鼠中来测试体内成像性能。使用具有NIR-I荧光成像设置的商业体内成像站(IVIS)观察到特异性和高肿瘤摄取，平均肿瘤背景比(TBR)在注射后72小时达到8，肝脏信号可忽略不计。注射后72小时处死小鼠，切除器官的NIR-I荧光成像证实了Pan-dsZW800-1具有非常高的肿瘤特异性。
dsZW1015的合成
该项目的下一步是将双带七次甲基染料的光谱范围扩大到在NIR-II区域（1000–1700 nm）吸收和发射的荧光染料，从而改善体内成像。最近商用InGaAs相机的出现极大地促进了荧光NIR-II成像，但目前进一步发展的限制是缺乏可以附着在目标生物分子上的相对较小（MW<2000 Da）的亲水性和两性离子NIR-II染料，例如抗体或亲和体，不会形成非荧光染料H堆叠或改变生物大分子的靶向特异性。NIR-II染料广泛的疏水表面积使得生产用于靶向生物成像的水溶性生物共轭物非常具有挑战性。众所周知的NIR-II花青染料是FD-1080，其结构包括疏水性苯并[c,d]吲哚杂环作为末端单元。在PBS溶液中，FD1080（和结构相近的类似物）形成非荧光H聚集体，因此必须将其配制为与血清蛋白的非共价复合物，或包装在自组装胶束或脂质体内用于体内成像FD-1080的第二个功能缺陷是缺乏合适的蛋白质缀合位点。为了解决这两个问题，作者采用模块化合成序列来制备双束缚、电荷平衡的NIR-II染料dsZW1015。关键的合成前体是七甲川染料5，它是从商业苯并[c,d]吲哚-2(1H)酮开始按四步顺序制备的。随后的两个步骤引入了可缀合的羧基并产生了无束缚的七甲川7，其被转化为所需的双束缚版本dsZW1015。值得注意的是，列出的所有化合物的非平面结构极大地促进了柱色谱纯化。
dsZW1015的光谱特性
NIR-II染料具有固有的低荧光量子产率，dsZW1015在DMSO中的测量值为 0.10%，在非极性有机溶剂中的测量值为0.11%，与文献中的NIR-II染料相当。在水中，NIR-II荧光量子产率甚至更低，但作者很高兴地发现，dsZW1015-1 (0.014%)在PBS中的荧光量子产率是未束缚异构体7的两倍多（0.006%）。亮度增加可能有两个原因。一是NIR-II荧光染料与周围水合球的空间屏蔽增强（类似于上述ZW800-1和4的比较），二是染料自聚集的显着差异。后一个因素的证据是通过检查吸收光谱获得的，该光谱表明PBS中的未束缚7在850 nm处表现出第二个蓝移且非荧光H聚集吸收带，而双束缚dsZW1015仅存在作为980 nm处的发射单体带。
使用dsZW1015进行体内成像
dsZW1015的NHS酯用于生产DOL = 1.2的Pan-dsZW1015缀合物。Pan-dsZW1015的吸收光谱仅在1000 nm处表现出发射单体染料峰，没有证据表明多种附加染料的 H堆积，并且在4°C下15天后光谱特性没有变化。据作者所知，dsZW1015是第一个与生物大分子偶联的两性离子七甲川NIR-II染料。Pan-dsZW1015的成像性能在JIMT-1小鼠肿瘤模型中进行了评估。体内全身NIR-II荧光图像显示出强烈的初始肝脏信号（4小时和24小时），这归因于附加的疏水性苯并[c,d]吲哚基染料的影响。尽管如此，在注射后72小时观察到明确的肿瘤靶向，并且脱靶信号非常低。成像结果表明，dsZW1015具有空间屏蔽和平衡电荷的良好结构组合，能够生产具有特定靶向特性的标记抗体，用于活体受试者的有效NIR-II成像。
结论
总之，作者已经验证了双束缚七甲川花菁染料是一类新型高性能、可共轭的近红外荧光团。与基准NIR-I染料ZW800-1相比，双束缚模拟dsZW800-1表现出略高的荧光亮度、显着更高的化学稳定性和两倍的光稳定性。值得注意的是，dsZW800-1在使用染料标记抗体的荧光成像方面优于ZW800-1，并且更适合测量植入的染料标记生物材料的长期降解或运输的纵向实验。值得注意的是，越来越多的荧光探针家族使用NIR-I七甲川花菁染料，其结构与ZW800-1密切相关，并且由于存在反应性4'-苯氧基，每种探针都可能存在稳定性限制团体。在每种情况下，都应该可以直接制备这些NIR-I染料的双束缚版本，并期望提高稳定性和成像性能。模块化合成方法的一个吸引人的特点是末端杂环可以变化的直接方式，正如双带七甲川花菁染料dsZW1015的制备所强调的那样，末端苯并[c,d]吲哚杂环可延长吸收/发射波长进入NIR-II区域。空间屏蔽和平衡电荷的结构组合抵消了dsZW1015内荧光染料增强的疏水性，并产生染料标记的抗体，可对活体小鼠的肿瘤进行有效的NIR-II荧光成像。未来的设计迭代可以在末端杂环内纳入合适的官能团，以产生这些双带花青染料的生物响应版本，用于生物共轭和部署作为下一代“开启”或“类比”近红外荧光探针。
参考文献
Doubly Strapped Zwitterionic NIR-I and NIR-II Heptamethine Cyanine Dyes for Bioconjugation and Fluorescence Imaging. Dong-Hao Li, Rananjaya S. Gamage, Allen G. Oliver, Nimit L. Patel, Syed Muhammad Usama, Joseph D. Kalen, Martin J. Schnermann, and Bradley D. Smith*. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202305062. DOI: 10.1002/anie.202305062
