内容提要
在光激发停止后具有持久发光的余辉成像为超灵敏分子成像提供了机会;然而，缺乏生物相容性的余辉剂阻碍了在临床环境中的开发。本研究提出了一种将普通光学试剂(包括荧光聚合物、染料和无机半导体)转化为余辉发光纳米颗粒(ALNPs)的通用方法。这种方法将级联光反应集成到单个粒子实体中，使ALNPs能够以化学方式存储光能，并在能量接力过程中自发地衰减光能。不仅可以对ALNPs的余辉廓线进行微调，使其在可见光到近红外(NIR)区域发射，而且可以通过数学模型预测其强度。具有代表性的近红外ALNPs允许在活小鼠中快速检测肿瘤，其信号背景比比近红外荧光高出三个数量级以上。ALNPs的生物降解性进一步增强了它们在体内超灵敏成像方面的潜力。
结果
ALNPs的制备。为了检验余辉设计的普遍性，对每个组分选择不同种类的物质来制备ALNPs。以RB(玫瑰孟加拉辛酯)、TPP(中四苯基卟啉)和NCBS(硅2,3-萘菁双(三己基硅基氧化物))作为代表性余辉引发剂，其激发和发射最大值分别为RB为576和591 nm, TPP为418和650 nm, NCBS为774和780 nm。余辉发光可由不同波长的光照射触发。选择3种1O2响应的化学发光分子，包括DO (N,N-二甲基-4-(3-苯基-5,6-二氢-1,4-二恶-2-基)苯胺)，SO (N,N-二甲基-4-(2-苯基-5,6-二氢-1,4-恶硫-3-基)苯胺)和HBA (3-((1r,3r,5R,7S)-金刚烷-2-亚基甲氧基甲基)苯酚)作为余辉底物，37,38，其化学发光范围为350 - 550 nm。测试了三种常用的荧光剂作为余辉继电器单元，包括半导体聚合物(SPs)、小分子染料(SMDs)和无机荧光团(IFs)，如半导体量子点(QDs)、石墨烯量子点(GQDs)和碳量子点(CQDs)。这些试剂的荧光发射范围从可见区域到近红外区域，为微调ALNPs的余辉谱提供了可行性。
通过与两亲性共聚物PEG-b-PPG-b-PEG共纳米沉淀法，采用不同组合的余辉引发剂、衬底和继电器单元制备了余辉造影剂。优化了ALNPs中各组分的掺杂比例。得到的50种ALNPs溶液制备后呈半透明，无明显析出物。动态光散射(DLS)显示，除基于CQDs的ALNPs (12 nm)外，ALNPs的水动力直径范围为80 ~ 180 nm。这应归因于CQD的固有亲水性和表面电荷。此外，透射电子显微镜(TEM)显示了这些ALNPs的球形形态。
在优化的光照时间(5 s)下，记录这些ALNPs的余辉发光。由于吸收不同，NCBS掺杂的ALNPs用808 nm激光照射(1 W cm−2)，而RB或TPP掺杂的ALNPs用白光照射(0.1 W cm−2)。正如预期的那样，在激光照射停止后，ALNPs被检测到发光，而仅由余辉引发剂和衬底或继电器单元组成的纳米颗粒几乎没有被检测到。这验证了所提出的余辉机制以及三种组分的协同作用。根据ALNPs组成的不同，其余辉发光光谱范围从可见区域到近红外区域。总的来说，ALNPs的余辉光谱与相应的荧光光谱相似。若有能量从余辉继电器单元传递到引发剂，则余辉谱的形状更接近引发剂的形状。反之，余辉发射更接近继电器单元的余辉发射。例如，由PFO、NCBS和DO组成的ALNPs(称为PFO-N-DO)在780 nm处具有强烈的近红外余辉发射，这是由于PFO向NCBS的二次能量转移;而由PFO、RB和DO组成的ALNPs(简称PFO-R-DO)由于PFO向RB的能量传递效率低，只能发射PFO的余辉。观察到几种ALNPs(特别是tpp掺杂的)的荧光和余辉光谱分布的差异，如GQD-N-DO, DiO-TPP-DO(称为DiO-T-DO)， CQD-R-DO等。这是因为余辉的光物理过程与荧光不同：在荧光过程中，光激发只导致荧光剂的发射，然后将势能传递给光敏剂；而在余辉过程中，除了这种势能传递外，还可以通过高能中间体(1,2-二西烷)释放的能量直接激发光敏剂。因此，余辉引发器和继电器单元之间的光物理相互作用提供了额外的空间来微调ALNPs的余辉轮廓，潜在地实现多路成像。
ALNPs的余辉强度各不相同。与相同余辉引发剂(NCBS)和继电器单元的纳米颗粒进行比较发现，在三种余辉底物中，掺杂DO的纳米颗粒具有最亮的余辉发光，其次是掺杂SO和HBA的纳米颗粒。此外，在所有测试的荧光剂中，在其他两种成分相同的情况下，基于PFVA的纳米颗粒具有最高的余辉强度。例如，PFVA-N-DO在所有掺杂ncbs的ALNPs中具有最亮的余辉发光，分别比PFVA-N-SO和PFVA-N-HBA纳米颗粒高12倍和123倍。光敏剂的变化也会影响ALNPs的余辉发光，因为产生1O2的能力不同。在其他成分相同的情况下，NCBS掺杂的ALNPs通常比TPP和RB掺杂的ALNPs具有更亮的余辉发光。然而，当荧光剂是PFVA时，情况就不是这样了。例如，PFVA-R-DO和PFVA-T-DO的余辉强度分别是PFVA-N-DO的4.6倍和4.1倍。这是因为PFVA在白光照射下产生了额外的1O2，而不是在808 nm照射下。因此，ALNPs的余辉强度由所有三种成分决定，但如果成分相同，则与颗粒大小无关。此外，余辉可以反复诱导，或在−20°C保存预辐照ALNPs后恢复。
余辉强度定量分析与预测。为了定量分析影响ALNPs余辉强度的因素，提出了一个数学模型。相对余辉强度(ΦAfterglow)定义为单个ALNP的余辉发光与由无余辉继电器单元的NCBS和DO组成的对照ALNP的余辉发光的比值(称为N-DO)。基于详细的余辉过程，检索并定义了4个描述符用于模拟。首先，由于余辉过程是从光敏化开始的，因此作者将余辉引发剂(Φs1)生成1O2的过程定义为第一描述符。如先前报道的，余辉衬底的化学发光性质和荧光剂(余辉继电器单元)的氧化电位对CIEEL很重要。因此，选择余辉底物与1O2反应后的化学发光量子产率(ΦCl)作为第二描述符；根据前沿分子轨道理论，定义余辉继电器单元(EHOMO)最高占据分子轨道(HOMO)的能级对应于氧化势为第三描述子。由于在这种通用方法中的余辉发射涉及余辉继电器单元和余辉引发剂之间的潜在SET，因此ALNP (ηFl)的相对荧光效率被定义为最后的描述符。该描述符由启动器和继电器单元确定，并通过单个ALNP的集成总荧光强度与对照ALNP N-DO的比值进行量化。经过监督学习分析，生成了四个描述符与ΦAfterglow相关的模拟方程，计算方法如下所示:
统计结果显示，所有描述词均与ΦAfterglow呈强相关( P < 0.05)。计算得到的Eq.(1)的决定系数(R2)为0.944(调整后的R2 = 0.936)，定量分析中所涉及的ΦAfterglow值的实测值和模拟值非常接近，都表明Eq.(1)对该余晖模型具有良好的适应性。根据式(1)，ΦAfterglow明显表现出非线性增量，有四个描述符与三个主要余辉分量的串扰有关。基本上，ALNP中增加1O2的产生、余辉衬底的化学发光、余辉接力单元的HOMO能级或荧光单元的荧光效率都有助于增辉。该模式与图2的实验数据吻合良好。因此，这些统计数据证明了选择描述子进行定量分析的合理性，也暗示了式(1)用于余辉预测的可行性。
为了测试所提出的方程的预测能力，使用另一种荧光剂CPV作为余辉继电器单元。注意CPV本身几乎不发出余辉发光。然而，通过掺杂CPV与余辉引发剂(NCBS)和底物(DO, SO，或HBA)的纳米配方后，检测到强烈的余辉发光。基于CPV的ALNPs的实验测量结果与Eq.(1)模拟ΦAfterglow的对比如图所示。令人印象深刻的是，在测量和估计Ln[ΦAfterglow]之间没有观察到显著差异(P > 0.05)，验证了式(1)用于估计这种通用余辉发光方法的预测可靠性。
组织穿透余辉发光。为了评估ALNPs的成像能力，作者比较了ALNPs与近红外荧光在不同组织深度的成像性能。此外，余辉性能以已报道的余辉剂SPN-NCBS5为基准。采用纳米沉淀法制备SPN-NCBS5，以PEG-b-PPG-b-PEG为基体，在MEHPPV中掺杂5 w/w%的NCBS。考虑到780 nm处的强余辉发光和近红外发射，作者选择了具有长期稳定性和良好细胞相容性的PFVA-N系列作为代表性的ALNPs。随着组织深度的增加，埋藏ALNPs的近红外荧光和余辉发光强度均显著降低。由于余辉成像的背景噪声最小，在所有组织深度，余辉图像的SBR都明显高于近红外荧光图像。值得注意的是，近红外荧光在3cm处几乎检测不到(SBR接近1)，而余辉发光仍然可以清晰地看到(SBR: 61±8; SBR表示为三个独立测量值的平均值±标准差)。这些数据表明，余辉发光的成像性能优于近红外荧光。此外，根据不同的余辉底物，在相同的组织深度下，PFVA-N ALNPs表现出与SPN-NCBS5相似(PFVA-N-HBA)甚至更高(PFVA-N- DO /SO)的余辉SBR。例如，在组织深度为2 cm时，PFVA-N-HBA的SBR(122±1)与SPN-NCBS5(116±1)相似，而PFVA-N-DO的SBR(248±10)和SO的SBR(191±36)分别是SPN-NCBS5的2.1倍和1.6倍，主要原因是其余辉亮度要高得多。其中，PFVA-N-DO(或SO)的最大成像深度为5cm (SBR: 26±1 PFVA-N-SO为6±1)，SPN-NCBS5的最大成像深度为4cm (SBR: 3±1)。这些结果不仅表明了PFVA-N ALNPs在余辉成像方面优于SPN-NCBS5，而且强调了ALNPs的设计灵活性，以进一步提高穿透深度和成像灵敏度。
体内肿瘤成像及生物降解研究。为了评价ALNPs在活体成像中的余辉性能，选择PFVA-N-DO作为活体小鼠肿瘤成像的代表性ALNP，并与近红外荧光进行比较。全身给药PFVA-N-DO后，肿瘤区域的余辉SBR显著增加，导致注射后1 h肿瘤可见。相比之下，近红外荧光SBR略有增加，因此只有在注射后4 h才能检测到肿瘤。注药后1 h，肿瘤区余辉SBR(2922±121)比近红外荧光(~1)高3个数量级。这种余辉SBR不仅在第一和第二近红外窗口都高于荧光成像(SBRs高达~135)，而且显著超过其他无激发成像方式的SBRs，包括化学发光(高达~20)、生物发光(高达~1000)和Cerenkov发光成像(高达~154)(补充表1)。这主要是由于化学发光、生物发光和Cerenkov发光成像通常依赖于可见发射。体外数据显示，PFVA-N-DO在肿瘤中的摄取是肝脏的0.58倍，进一步证实了其被动靶向肿瘤的能力。这些数据强调，通过PFVA-N-DO介导的余辉成像可以更快地检测肿瘤，与其他光学试剂相比具有更高的对比度和灵敏度。
随后进行生物降解和体内清除研究，以检查PFVA-DO-N的生物安全性。为了模拟体内环境，作者使用在吞噬细胞中大量表达的髓过氧化物酶(MPO)作为氧化酶进行体外生物降解。在过氧化氢(H2O2)存在下，MPO催化次氯酸(HClO)的产生以消化外来物质。PFVA-N-DO与MPO和H2O2孵制过夜后，PFVA在450nm处的吸光率显著下降，表明MPO对PFVA的破碎作用。凝胶渗透色谱(GPC)进一步证实了生物降解，MPO处理后PFVA的分子量明显降低。如此高效的降解应归因于PFVA共轭骨架中氧化诱导的双键裂解，这在之前的报道中。
为了监测PFVA-N-DO的体内清除，将它们系统地给药到小鼠体内，然后进行长期近红外荧光记录。给药后，肝脏的近红外荧光信号随时间增加，并在注射后3天达到最大值。随后，在注射后33天，肝脏的近红外荧光持续下降到几乎无法检测到的水平。这些结果表明，在活体动物中，PFVA-N-DO可通过肝胆排泄长期清除。此外，PFVA-N-DO系统给药33天后，活鼠主要器官未见明显组织学损伤，表明PFVA-N-DO具有良好的生物相容性。
讨论
总之，作者报道了一种将传统荧光剂转化为新余辉剂库的通用方法。通过三个关键组成部分(余辉引发剂、衬底和中继单元)的高效粒子内级联光反应，ALNPs能够化学存储光能，并在光激发停止后自发发出长寿命的发光。这种简便的方法适用于广泛的成分:RB、TPP或NCBS作为引发剂，DO、SO或HBA作为物质，无机或有机荧光团作为继电器单元。纳米粒子内部复杂但相当可控的光化学相互作用允许通过调整ALNP组成来微调从可见到近红外区域的余辉发射。为了阐明这一通用余辉过程中涉及的因素，从监督学习分析中生成了一个基于4描述子的数学模型(Eq.(1))，该模型准确地预测了未知ALNP成分的余辉强度。以PFVA-N-DO ALNPs为例，余辉在生物组织中达到了最大成像深度5 cm，比报道的余辉剂(4 cm)更深。与近红外荧光相比，ALNPs的余辉显示出3个数量级的高SBR(2922±121)，允许在系统给药后更快地检测活小鼠的肿瘤。据作者所知，这是迄今为止在体内光学成像中获得的最高SBR，无论其光学模式和检测波长如何。结合无重金属的良性性质，具有代表性的PFVA-N-DO ALNPs具有酶生物降解性和可清除性，并具有良好的长期生物相容性，进一步保证了其在体内的应用。因此，他们的研究显示了一种可控的纳米工程方法，几乎适用于所有种类的荧光团，无论其组成如何，用于无背景分子光学成像。
参考文献
A generic approach towards afterglow luminescent nanoparticles for ultrasensitive in vivo imaging. Jiang, Y., Huang, J., Zhen, X. et al. Nat Commun 10, 2064 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-10119-x
