内容摘要
通过一种分子药物在恢复先天细胞凋亡的同时抑制转移是一种有效的肿瘤治疗方法。在这里，一种大的刚性和V形的NIR-II染料DUT850被合理地设计用于潜在的心磷脂(CL)靶向化疗-光疗应用。DUT850具有中等的NIR-II荧光，优异的光动力疗法(PDT)和光热疗法(PTT)性能，以及超高的光稳定性。更重要的是，DUT850独特的刚性V型骨架、正电荷和亲脂性使其能够与CL特异识别和有效结合；DUT850−CL的这种相互作用诱导了一系列生理紊乱，包括细胞色素c的移位、钙超载、活性氧爆发和ATP耗竭，这些不仅激活了癌细胞的凋亡，而且在体内外都抑制了肿瘤的转移。此外，DUT850−CL的紧密结合提高了DUT850在安全的808 nm激光(330 mW cm−2)照射下对癌细胞(IC50低至90 nm)的光毒性。被牛血清白蛋白包裹后DUT850@BSA，对4T1肿瘤小鼠模型产生协同的化学-光动力疗法−PTT效应，最终导致实体瘤的消灭和转移抑制，并可与DUT850的近红外II荧光实时跟踪。这项工作为通过靶向关键的上游效应来重新激活癌细胞的凋亡网络和激活抗转移途径提供了一条很有前途的途径，这将为抑制肿瘤的增殖和转移带来医学上的福音。
结果与讨论
分子设计基础和合成路线。CL是一种独特的非双层磷脂。首先，CL具有一个相对较小的带负电荷的极性头部基团(−2)和4个疏水的酰基链，其尾部比头部宽，形成明显的锥形分子。致密的阴离子极性头部和锥体形状有助于脂质−蛋白的亲和力。此外，两种磷酸盐捕获一个质子并与连接的甘油的羟基一起形成双环阵列，留下疏水空间。在IMM中，CL聚集成簇，从而形成CL结构域，用于拴系和稳定线粒体膜蛋白。鉴于CLS的这些独特特性，具有特定形状(V形到锥形空腔)和正电荷(+1到−2)的刚性平面结构有望通过结构、疏水和静电互补识别CLS，然后干扰CL结构域，最终影响CL相关蛋白质的功能。
考虑到这一点，我们设计并合成了具有对称蝴蝶状大π骨架的七个六元环DUT850。DUT850的设计思想来自于对短波长V型黄杂菲染料的共轭结构的扩展(Scheme 1a)。为了减少π−π的堆积，增强亲脂性，在不改变给体−π−受体结构的情况下简化合成，合理地用脂肪环取代芳环。这种扩展的共面共轭促进了电子的离域，从而赋予了DUT850很强的长波吸收/发射性能。最重要的是，带正电的V型结构具有高刚性和较强的亲油性，有利于插入CLs的填充层，并与其内部带负电的空腔匹配良好。此外，DUT850的阳离子特性也使其有可能穿透细胞膜并积聚到线粒体中，这是靶向CL的先决条件。
根据逆合成分析(Scheme 1)，以水杨醛、2-环己酮和苯甲醛为原料，经简单的三步反应合成了V形DUT850。水杨醛和2-环己烯酮的Domino Oxa-Michael−羟醛缩合反应得到起始中间体A，然后A和苯甲醛发生羟醛缩合反应得到B。最后，通过三氟化硼催化的环合反应高产率(60%)合成了DUT850。
DUT850的光学性质和光活性。DUT850的这种大的π骨架提供了高度的电子离域，导致在650到950 nm之间有强烈的近红外吸收，最大吸收集中在850 nm。此外，DUT850还在480和590 nm处显示了两个较高的能量吸收带，可能属于S0→S3和S0→S2跃迁。详细的光学特性表明，DUT850具有较高的摩尔消光系数[∼8×104 M−1 cm−1in二氯甲烷] 表明其优良的近红外光收集能力。此外，DUT850的荧光发射延伸到组织透明的NIR-II窗口，最大发射集中在960 nm，在DCM中的荧光量子产率高达0.5%，使DUT850成为非侵入性实时引导体内光疗的理想选择，背景自荧光减少，光子散射减少，以及深层组织的高分辨率。
然后，我们研究了DUT850的光动力学和光热性能。如DPBF脱色曲线所示，用808 nm激光照射DUT850可在不同的溶剂和激光功率密度下产生出色的1O2。1O2量子产率(ΦΔ)高达0.19 与IR780对比(ΦΔ，0.127)。此外，在连续的808 nm激光照射下，DUT850也观察到明显的浓度和激光功率依赖的温度升高(ΔT)。光热转换效率(η)为60%，高于ICG(16%)等典型光热剂，表明其具有显著的光热转换能力。更重要的是，DUT850在水溶液中的光稳定性优于ICG和IR780。令人惊讶的是，DUT850在各种有机溶剂中也表现出很高的光稳定性，这增加了它相对于普通近红外染料的竞争优势。总而言之，DUT850强烈的近红外吸收、中等的近红外荧光、出色的光诱导1O2、热产生和优异的光稳定性清楚地表明，DUT850可以作为一种理想的光疗剂用于超敏感肿瘤成像和高效光疗。
DUT850与CL的特异性结合。接下来，为了确定DUT850是否能与CL特异性结合，我们在体外和活细胞中采用了不同的方法。首先，测定了DUT850在模拟磷脂双层膜的一系列脂质体(SPC−脂质体和SPC−CL-脂质体)中的荧光性质，以DUT850在两种脂质体中的近红外荧光随其浓度的变化为初步指标。当DUT850的浓度大于20 μM时，DUT850在SPC−脂质体和SPC−CL脂质体中的荧光强度明显高于在磷酸盐缓冲盐水中的荧光强度，说明这两种脂质体都提供了DUT850的分散环境，而DUT850则在水中聚集。令人惊讶的是，当[DUT850]小于20 μM时，DUT850在SPC−CL脂质体中的荧光被完全猝灭，但在SPC−脂质体中仍有较强的发光。此外，当用其他带负电荷的磷脂[PA，PG，L-α-磷脂酰肌醇(PI)，PS，PIPs]取代CL时，DUT850的荧光与对照组(SPC)几乎没有差异。对比发现，DUT850与CL有特异性结合，刚性强、亲油性强的V型DUT850极有可能嵌入CL的填充层，导致荧光猝灭。然后，通过脂质单层模型实验进一步证明DUT850对CL的亲和力强于其他脂类。二甲基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻基磷脂酰乙醇胺和胆固醇是IMM的代表性成分，而1，2-二肉豆蔻基甘油-3-磷酸、1，2-dimyristoyl-sn-glycero3-phospho-(1′-rac-glycerol)，1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine，PI和1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′myo-inositol-3′，4′，5′-trisphosphate)(PI(3，4，5)P3)是代表对照负电荷的磷脂。CL单层吸附了更多的DUT850，证实DUT850确实优先与CL结合。此外，DUT850对CL的选择性也优于BSA，因为低浓度的BSA(<0.5 mg/mL)不会促进DUT850的荧光。
其次，ITC提供了直接证据和详细的约束性信息。光谱符合1：4(DUT850与CLs)结合模型，并提供了形成DUT850-CL络合物的焓(ΔH=−30.22 kJ mol−1)、熵(−TΔS=0.67 kJ mol−1)和吉布斯自由能变(ΔG=−29.55 kJ mol−1)以及解离常数(Kd=6.654 μM)。结果表明，DUT850−CL络合物的形成是一个自发放热过程，主要受范德华作用力和离子键的驱动。相比之下，DUT850与其他脂类结合的ITC图谱表明，在相同的条件下，基本上没有热变化，这表明它们的亲和力很弱。
最后，我们通过活细胞中的竞争结合实验验证了CL锚定能力，其中CL特异的探针10-N-壬基吖啶橙(NAO)被引入与DUT850共染色。NAO的荧光在4T1细胞之间显示出在CCCP(一种线粒体膜电位解偶联剂)预处理前后无法检测到的波动。这一现象表明，NAO与CL的结合不依赖于线粒体膜电位，这与以往关于NAO探针的报道一致。同时，单独定位于线粒体的典型染料IR780也没有引起NAO的荧光变化，这不仅表明IR780与CL缺乏结合亲和力，更重要的是强调了单纯的线粒体靶向染料不会阻碍NAO−CL的相互作用和荧光信号的输出。相反，当4T1细胞与DUT850预先孵育0.5 h后，再用NAO染色，则不能捕捉到荧光。当先用NAO染色，再用DUT850染色时，NAO的荧光强度明显下降，表明NAO的−CL结合部位被DUT850占据。这些结果充分表明，在4T1细胞中，DUT850对CL的亲和力明显强于NAO。此外，除线粒体外，DUT850对溶酶体、内质网、高尔基体和肌动蛋白等亚细胞器的完整性没有造成明显破坏，表明大多数染料存在于线粒体中，并与CL结合。
DUT850−CL相互作用的MD模拟。为了进一步验证和可视化DUT850−CL的相互作用，在磷脂双层模型上进行了MD模拟。DUT850在前10 ns内从水相快速提取到磷脂双层中。随着时间的推移，CL(红色)逐渐聚集在DUT850附近，而其他磷脂(蓝色)则被置换。最终，在DUT850附近形成了一个富含CL的区域，这表明DUT850可以从数千个磷脂分子中选择性地与CL结合。这一趋势可以用DUT850与CL的络合自由能很好地解释。DUT850−CL的相互作用力主导了DUT850与整个磷脂双层体系之间的相互作用力之和。此外，DUT850−CL的相互作用能主要由短程Lenard-Jones势和库仑势组成，揭示了DUT850−CL的特异性结合是由范德华力和静电相互作用驱动的，这与国际贸易委员会的结果一致。综上所述，无论是在水溶液中还是在复杂的细胞内环境中，DUT850都与CL特异性结合，证明了分子设计策略的成功。
DUT850−CL结合诱导细胞色素c释放。Cyt c是一种优先与CL结合的促凋亡因子。最近的证据支持，CL−Cyt c复合体的破坏为线粒体固有的凋亡途径提供了关键的启动子。因此，我们怀疑DUT850在移位到IMM后，由于CL锚定能力，可能会在CL丰富的区域与Cyt c竞争。结果，重塑的CL结构域形成了一个“凋亡触发器”，将Cyt c从线粒体释放到胞浆中，激活下游的生化过程，导致细胞程序性死亡。这是设计分子靶向化学发光的主要目的之一，因此，我们进行了以下实验来验证我们的假设。
首先，进行了分子动力学模拟，证实了DUT850−CL的强结合将不可逆转地破坏CL−Cyt c复合体。CLs和Cyt c通过其长脂肪链和两个负电荷紧密接触，而CLs−Cyt c的结合构型在加入DUT850后发生了变化。轨迹图显示，DUT850可以快速从水相中钻出，100 ns时，它完全嵌入在CLs和Cyt c之间。从剖面图中可以看到，DUT850被CLs的长链缠绕，带正电荷的氨基吸引了CLs的带负电荷的磷酸头。彩色填充的δg等值面显示DUT850被绿色区域包围，这表明范德华力在稳定DUT850−CL络合物中起着至关重要的作用。结果，CLs和Cyt c之间的静电相互作用下降到对照组的∼1/6，表明DUT850成功地中断了CLs和Cyt c的相互作用，从而保证了Cyt c的离开，随后引发了下游的级联启动。
DUT850−CL作为“细胞凋亡触发器”诱导的细胞凋亡通路激活。为了通过DUT850与CL的结合来确认细胞凋亡的重新激活，我们首先进行了蛋白质印迹(WB)分析，以确定线粒体(Mito-Cyt c)和细胞质(Cyto-Cyt c)中Cyt c的含量变化。随着DUT850浓度的增加，细胞内有丝分裂细胞c的含量显著增加，而有丝分裂细胞c的含量显著下降，经统计，3 μM DUT850作用24 h后，有丝分裂细胞c的含量下降到对照组的1/7，同时，细胞有丝分裂细胞c的含量∼升高3倍。这种剂量依赖关系表明，DUT850确实诱导了Cyt c从线粒体释放到胞浆中。
WB法检测细胞凋亡相关标记物的表达。caspase-3和PARP均呈剂量依赖性上调，表明DUT850诱导的Cyt c易位成功地触发了caspase和关键蛋白裂解的级联反应。此外，实时共聚焦成像进一步证实了caspase-3的激活。在孵育60min后才观察到亮绿色荧光，随着时间的推移逐渐加深，并在120min时充满整个细胞。同时，细胞呈现明显的凋亡特征，如细胞泡沫化和出芽。此外，我们还通过流式细胞术进一步量化了细胞的凋亡率。细胞凋亡率与孵育浓度和孵育时间呈显著正相关，例如，当孵育时间从0.5 h延长到4 h时，细胞凋亡率增加了10倍(从8.34增加到83.7%)。
上述现象证实了DUT850确实诱导了癌细胞的凋亡。此外，根据caspase-3和PARP WB的结果，我们可以推测DUT850诱导的细胞凋亡属于线粒体内源性途径。释放的Cyt c首先与细胞死亡适配器APAF-1相互作用，形成激活原caspase-9的凋亡体，然后caspase-9触发执行caspase激活。一旦被激活，caspase-3进一步裂解蛋白质PARP，最终协调细胞的有序死亡和吞噬。与传统的化疗药物通过向线粒体发送凋亡信号来间接触发Cyt c释放非常不同，优秀的CL锚定能力使DUT850通过在CL丰富的区域与Cyt c激烈竞争，直接从源头强制启动Cyt c的释放。
DUT850−CL引起的细胞内生理紊乱。除了触发细胞凋亡外，DUT850与CL的强结合还通过干扰其他CL相关蛋白[如MCU、钙的储存、ATP合成酶和ADP/ATP载体(AAC)]而引起一系列生理障碍。首先，图清楚地显示，随着孵育时间的延长(DUT850)，细胞内的钙离子被吐出，胞浆中的钙离子数量稳步增加，表明钙离子的动态平衡被破坏。此外，DUT850染色的4T1细胞出现明显的ROS爆发和线粒体膜损伤。前者主要归因于Cyt c易位导致线粒体电子传递链受阻，不能及时传递电子，从而使多余的电子转移到氧中产生ROS。最后，随着DUT850浓度的增加，对照组的ATP产生也有减少的趋势。
DUT850对肿瘤细胞的增殖抑制和选择性杀伤作用。这样的细胞内严重紊乱，包括钙离子紊乱、ROS生成增加和ATP生成减少，将不可避免地影响细胞活力。DUT850具有广谱杀癌作用，IC50低，抗癌效果优于一些常规化疗药物。此外，DUT850对癌细胞具有明显的选择性杀伤作用。值得注意的是，在可确保充分杀灭癌细胞的浓度下，DUT850对正常乳腺细胞几乎没有毒性，正常细胞株(LO2和MCF10A)的IC50(24或48小时)显著高于癌细胞(HepG2、MDA-MB-231、MCF-7和4T1)。这主要是因为癌细胞中的CL比正常细胞中的CL更容易受到外界干扰；根据先前的研究，与CL的轻微相互作用很容易在癌细胞中重新建立促凋亡途径或使生存计划失效；因此，DUT850对癌细胞的损害比正常细胞更大是合理的。
DUT850诱导的抗肿瘤转移作用。众所周知，癌细胞的迁移和侵袭是一个多步骤的过程，受Ca2+、ROS的调节，并受ATP的刺激。典型的情况是，细胞头部局部Ca2+浓度的增加可以诱导细胞产生基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9，从而进一步促进细胞的侵袭，引导细胞向趋化信号移动。钙离子失衡、ATP减少和ROS增加肯定会切断癌症转移和侵袭所需的信号和能量供应。
划痕和跨井实验表明，DUT850不仅对细胞的横向迁移有很强的抑制作用，而且在很低浓度下也能抑制细胞的纵向迁移和侵袭活动。对照组48 h后划痕创面完全愈合(迁移抑制率为0%)，而DUT850治疗组创面几乎没有愈合(迁移抑制率∼为100%)。此外，在跨井室的下部几乎没有观察到明显的细胞，当[DUT850]仅为1 μM时，迁移和侵袭率显著降低到不到20%。随后，在4T1荷瘤小鼠模型上进一步验证了DUT850良好的抗转移能力。PBS组小鼠离体肺可见明显的结节，HE染色可见肺组织的许多正常结构已被肿瘤细胞侵袭，提示肿瘤细胞向肺内的高迁移。而DUT850治疗组肺组织结构清晰完整，无论是在真实肺组织中还是在HE图像中都几乎找不到肿瘤结节或细胞。此外，与PBS组相比，DUT850治疗组有明显的抑瘤作用，0.1 mg kg−1DUT850的抑瘤效果好于20 mg kg−1CTX。上述结果提示，DUT850不仅能抑制原位肿瘤的生长，还能抑制肿瘤的转移。为了揭示其抗肿瘤转移的机制，我们在体内进一步检测了转移相关因子的表达，包括基质金属肽酶(MMP2和MMP9)、转化生长因子β(TGFRβ)和血管内皮生长因子。与对照组相比，DUT850处理组中所有这些基因的表达都显著下调，突显了DUT850突出的抗转移能力。
体外光毒性分析。除了使DUT850具有突出的化疗效果外，CL靶向能力极大地提高了DUT850的光疗效果，因为DUT850的−CL的紧密结合允许直接的CL过氧化，并在其失活之前增加了CL和ROS的碰撞。与CL结合后，DUT850的光动力和光热效应保持在较高的水平。此外，在相同的光照条件下，DUT850在癌细胞中引起的脂质过氧化(LPO)比IR780(单独的线粒体定位染料)要多得多。DUT850对4T1细胞的光毒IC50值可降至90 nM，而IR780在10 μM的浓度下几乎不会导致细胞死亡，这表明CL靶向光动力疗法是一种比单纯靶向线粒体的方法更猛烈和有效的方法。
在活体NIR-II FL成像引导的PDT和PTT中。DUT850@BSA纳米粒具有均匀的直径约100 nm，ζ电位为负的−19.0 mV，有利于通过增强渗透性和滞留效应在肿瘤中有效积聚。CL没有猝灭DUT850在BSA中的荧光，表明没有发生染料泄漏。此外，尽管DUT850被困在BSA(DUT850@BSA NPs)中，但DUT850仍与CL结合，并在被癌细胞摄取时发挥良好的抗转移能力。
然后，小鼠皮下注射4T1肿瘤(静脉注射)。注射DUT850@BSA纳米粒(0.1 mgkg-1)，研究其在体内的分布。肿瘤部位DUT850@BSA纳米粒子的近红外-II荧光在注射后12小时内急剧增加，并在注射后20小时达到最大。值得注意的是，即使在48 h后，肿瘤部位的荧光仍然清晰可见，并在3d后消失，这表明DUT850@BSA纳米粒子具有有效的肿瘤靶向性和长期滞留，这对精确的光疗非常有利。体外肿瘤图像再次证实了这一点。
接下来，对体内光疗进行了进一步的评价。在NIR-II荧光引导下，小鼠静脉注射。注射DUT850@BSA纳米粒(0.1 mg kg−1 DUT850)，接受808 nm激光(0 33 Wcm−2)照射。DUT850@BSA纳米颗粒加808 nm激光治疗的肿瘤在10 min内持续升温至∼45°C。与单独注射PBS和PBS+808 nm组相比，单独注射DUT850@BSA纳米粒子可以显著延缓肿瘤的生长，表明DUT850具有良好的体内化疗效果。在接受808 nm激光照射后，肿瘤被清除，没有复发，这要归功于DUT850的自协同光化学效应。
各组肿瘤重量也证实了疗效显著。此外，H&E和TUNEL染色图像还提供了肿瘤损伤的进一步视觉证据。DUT850@BSA纳米粒照射或不照射均可诱导肿瘤细胞严重凋亡，而与之形成鲜明对比的是，PBS组小鼠肿瘤细胞极少发生凋亡或坏死。此外，DUT850@BSA NP治疗组小鼠的寿命显著延长(>22天)，无一例死亡。血液生化和血常规指标、肝功能指标和肾功能指标的生物安全性评价表明，与对照组相比，DUT850@BSA纳米粒对小鼠没有损害。此外，注射DUT850@BSA纳米粒小鼠的主要器官未见实质性损伤或明显的炎症病变，未见体重减轻或死亡，表明DUT850@BSA纳米粒具有良好的生物相容性，治疗过程对正常组织无毒性。
结论
在本工作中，我们设计并合成了一种新型的近红外染料DUT850，它具有大的斯托克斯位移、强的近红外-I吸收、中等的近红外-II荧光、高效的光动力学和光热性能。最重要的是，DUT850对线粒体亚区的关键脂质CLs显示出特异性的识别和强烈的干扰。通过与CL结合，DUT850引起了一系列的细胞内紊乱，包括细胞色素c脱落、促进ROS爆发、耗尽ATP含量、破坏细胞内钙稳态等。因此，DUT850单独作为一种化疗药物，在体内外均能多管齐下，有效地触发细胞凋亡，抑制肿瘤转移。此外，DUT850的抗癌性能在近红外光的作用下得到了增强，其光毒IC50降至90 nm。DUT850固有的自协同化疗的PDT−PTT在体内移植的4T1荷瘤小鼠身上证明能消除实体瘤而没有任何转移。我们的结果为靶向连接细胞凋亡和转移途径的关键上游效应因子以获得更精确和有效的癌症治疗提供了一个概念验证。
参考文献
Cardiolipin-Targeted NIR-II Fluorophore Causes “Avalanche Effects” for Re-Engaging Cancer Apoptosis and Inhibiting Metastasis. Hui Bian, Dandan Ma, Fei Pan, Xiaodong Zhang, Kai Xin, Xinfu Zhang, Youjun Yang, Xiaojun Peng, and Yi Xiao. J. Am. Chem. Soc.2022, 144, 49, 22562–22573 ，https://doi.org/10.1021/jacs.2c08602
