内容摘要
免疫系统实时成像有利于疾病的早期诊断和精准免疫治疗；然而，大多数现有的成像探针要么具有与免疫反应相关性较差的“始终开启”信号，要么依赖于成像深度有限的光激发。在这项工作中，开发了一种超声诱导余辉 (sonoafterglow) 纳米探针，用于特异性检测颗粒酶 B，以便对体内 T 细胞免疫激活进行精确成像。声余辉纳米探针 (Q-SNAP) 由声敏剂、余辉基质和猝灭剂组成。超声波照射后，声敏剂产生单线态氧，将底物转化为高能二氧杂环丁烷中间体，在超声波停止后缓慢释放能量。由于接近，来自基底的能量可以转移到淬灭剂，导致余辉淬灭。只有在颗粒酶 B 存在的情况下，猝灭剂才会从 Q-SNAP 中释放出来，从而产生明亮的余辉发射，检测限（LOD，2.1 nm）远低于大多数现有荧光探针。由于超声波可穿透深层组织，因此可穿过 4 厘米厚的组织引起声余辉。基于 超声诱导余辉和颗粒酶B之间的相关性，Q-SNAP 不仅可以在探针注射后4小时内区分自身免疫性肝炎和健康肝脏，而且可以有效监测环孢素 A 介导的 T 细胞过度激活的逆转。因此，Q-SNAP 提供了动态监测 T 细胞功能障碍和评估深部病变预防性免疫治疗的可能性。
结果与讨论
猝灭剂的合成路线如图所示。首先，通过固相肽合成获得GZMB可切割肽。该肽具有 1) 赖氨酸胺基团，通过酰胺键与 BBQ-650 缀合，2) 叠氮基团，通过铜 (I) 催化的点击反应与 DSPEPEG1000-炔烃缀合。为了获得 Q-SNAP，使用两亲性聚合物 PEG-b-PPG-b-PEG 将声敏剂 NCBS、底物 DPA 和猝灭剂以不同的掺杂比例掺入纳米颗粒中。相反，随着猝灭剂用量的增加，Q-SNAP 的声余辉降低，质量比为 1:4（BBQ-650 与 DPA）时，Q-SNAP 的声余辉比 SNAP 低 28.1 倍，表明猝灭剂量依赖性BBQ-650 的声余辉；与此同时，NCBS 的荧光减弱程度较小。在没有猝灭剂的情况下，SNAP 在超声应用后发出明亮的声余辉，其中涉及余辉中继的信号放大，由于余辉发射之间的光谱重叠，从激发的 DPA* 到高荧光 NCBS 的非辐射能量转移（荧光量子产率：17%） DPA 的含量和 NCBS 的吸光度（支持信息）。Q-SNAP 在超声应用时产生的 1O2 量与 SNAP 相似，表明声敏化不受猝灭剂的影响（支持信息）。 Q-SNAP 的粒径随猝灭剂的增加而增大，在磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.01 m，pH 7.4）中，质量比为 1:4（BBQ-650 与 DPA）时，粒径约为 65 nm，并在 37 ℃下保持稳定至少 5 天。由于有效的声余辉淬灭和良好的尺寸，Q-SNAP 以 1:4 的质量比（BBQ-650 与 DPA）用于后续实验。由于 1O2 的产生量较高，Q-SNAP 的声余辉强度随着超声功率强度 (0.5–2 W cm−2) 和照射时间 (10–60 s) 的增加而增加。考虑到高超声剂量对细胞的潜在损伤，选择中等功率强度 1.5 W cm−2 和持续时间 30 s。
为了测试 GZMB 响应性，将 BBQ-650 肽 (Q-pep) 与 GZMB 一起孵育，并通过高效液相色谱 (HPLC) 进行分析。与 GZMB 孵育 0.5 小时后，在 7.1 分钟时观察到一个新峰，这归因于 Q-pep 片段（即 SGGK-BBQ650，通过质谱验证）。GZMB 对 Q-pep 的酶米氏常数 (Km)、催化速率常数 (kcat) 和催化效率 (kcat/Km) 分别计算为 84.9 μm、0.035 s−1 和 412.0。这些表明 GZMB 对 Qpep 裂解的高周转率，与之前的报告相当。相比之下，Q-SNAP 的 GZMB 的 kcat/Km 仅 68.3。较低的动力学可能是由于纳米级 Q-SNAP 对 GZMB 的空间位阻。
然后测试了 Q-SNAP 的 GZMB 响应能力。与GZMB孵育1.5小时后，Q-SNAP的声余辉和荧光强度分别增强21.8和1.7倍，与SNAP相似。这证实了 GZMB 几乎裂解了几乎所有肽以完全释放 BBQ-650。 GZMB 预激活 Q-SNAP 的半衰期经测量约为 1.5 分钟，足以进行体内成像。值得注意的是，GZMB 的检测限 (LOD) 确定为 2.1 nm，优于几种报道的基于四肽的荧光探针（例如，N-乙酰基-异亮氨酰-谷氨酰-脯氨酰-天冬氨酰的检测限为 25 nm，和 T1 探针为 17 nm），与化学发光探针相当（例如，探针 1 [为 0.7 nm）。相比之下，与 caspase-3 (Cas-3)、γ-谷氨酰转移酶 (GGT)、组织蛋白酶 B (CTSB)、中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE)、基质金属蛋白酶 (MMP2/9) 一起孵育后，Q-SNAP 的声余辉几乎没有增强。表明 Q-SNAP 对 GZMB 具有高度特异性。此外，在用超声波照射五个周期的 GZMB 预激活 Q-SNAP 中观察到类似的信号强度，证实了 sonoafterglow 的可充电性。这些特性凸显了 Q-SNAP 介导的声余辉成像在生物医学应用中的潜力。
为了测试声余辉的深层组织激活，用超声波照射GZMB预激活的Q-SNAP，并通过不同厚度的鸡胸组织检测声余辉。荧光和声余辉信号均随着组织厚度的增加而减少。特别是，即使穿过 4 cm 的组织厚度（SBR = 4.4），也可以诱导和检测声余辉；相反，在 1 cm 处几乎检测不到荧光信号 (SBR = 3.2)。深层组织激活声余辉能够对体内深部病变进行成像。
在体外过表达 GZMB 的 CTL 中研究了 Q-SNAP 检测细胞内 GZMB 的能力。CTL 是通过将小鼠脾脏来源的 T 细胞与模拟 T 细胞扩增和启动的 CD3/CD28 激活剂珠一起孵育而获得的。 GZMB阴性肝细胞用作对照。与 Q-SNAP 孵育 4 小时后，在所有细胞组中均观察到荧光，表明 Q-SNAP 的细胞摄取良好。值得注意的是，CTL 显示出最强的荧光和声余辉，其强度分别比未处理的 T 细胞高 1.8 和 8.3 倍，比肝细胞高 3.1 和 16.1 倍。此外，用 GZMB 抑制剂（Z-IETD-FMK 肽）预处理的 CTL 的荧光和声余辉强度分别降低了 1.7 倍和 5.7 倍。这些表明 Q-SNAP 的细胞内激活是由于 CTL 中富含活性 GZMB 所致。此外，与 Q-SNAP 一起孵育 24 小时的 T 细胞与用 PBS 处理的 T 细胞相比，其活力和 GZMB mRNA 水平没有差异，即使与高浓度的 Q-SNAP（80 μg/mL）一起孵育后，>80% 的细胞仍然存活。 −1 相当于 DPA）和超声照射，表明 Q-SNAP 不影响细胞增殖和激活。这些结果证实了 Q-SNAP 在 T 细胞免疫激活成像中的可行性。
当宿主免疫系统攻击肝细胞时，就会发生 AIH，引起急性/慢性炎症，从而导致肝硬化、肝细胞癌和死亡。AIH的特点是自身抗原引发的T细胞浸润和扩张；因此，体内检测肝浸润T细胞有利于早期诊断。Q-SNAP 的体内 T 细胞成像能力在鼠伴刀豆球蛋白 (ConA) 诱导的肝炎中进行了测试，这是一种模拟人类 AIH 的公认模型。在静脉注射 Q-SNAP 之前 4 小时用 ConA 处理小鼠，然后进行纳米颗粒追踪的纵向荧光成像和 T 细胞激活的声余辉成像。注射后，NCBS在小鼠肝脏区域的荧光强度在24小时时增加到最大值，并在48小时后降低到背景水平。Q-SNAP 如此有效的肝脏积累归因于 PEG 涂层的适当尺寸和长循环特性。在荧光成像的每个时间点，用超声波照射肝脏区域以诱发声余辉。因此，注射 Q-SNAP 后 4 小时，ConA 处理小鼠肝脏区域的声余辉强度 (SBR = 23.3) 明显高于 PBS 处理小鼠（P = 0.038，2.4 倍），这比两组之间荧光信号显着差异的时间点至少早4小时（P = 0.020，1.3倍）。此外，超声余辉在报告肝损伤方面与临床血液丙氨酸转氨酶 (ALT) 测试具有相似的敏感性，这表明注射 Con-A 后 6 小时两组之间存在显着差异。肝脏区域的声余辉在注射 Q-SNAP 后 16 小时达到最大值（SBR = 58.3），其强度在 ConA 处理的小鼠中是 PBS 处理的小鼠的 4.8 倍。相比之下，ConA 处理小鼠的肝脏荧光达到最大值（注射 Q-SNAP 后 24 小时，SBR = 15.7）仅比 PBS 处理小鼠的肝脏荧光亮 1.2 倍。一致地，ConA 处理的小鼠的离体肝脏显示出比 PBS 处理的小鼠更亮的荧光和声余辉（离体超声再充电后）2.1 和 4.6 倍。这些结果证实声余辉可以在肝脏中重复激活，并且在报告 AIH 方面比荧光更敏感。此外，在肝脏和肾脏中观察到的荧光表明 Q-SNAP 通过肝胆和肾脏途径排泄，并在注射后 48 小时内从主要器官中清除。
免疫抑制是一种通过抑制 T 细胞活化来治疗 AIH 的临床疗法；然而，其剂量限制性毒性长期以来一直是一个安全问题。 为了测试Q-SNAP是否可以监测免疫抑制治疗的预防效果，在注射ConA前16小时给小鼠静脉注射环孢素A（CysA），然后注射Q-SNAP进行纵向成像。在用 CysA+ConA 治疗的小鼠中，声余辉信号比单独用 ConA 治疗的小鼠低 2.8 倍，而它们的荧光信号显示出可忽略不计的差异（1.2 倍）。这些数据表明 Q-SNAP 声余辉成像可以有效监测免疫抑制剂对深部肝脏的预防作用。为了验证超声余辉信号与 T 细胞激活相关，对所有小鼠的肝脏进行了流式细胞术分析。与 PBS 相比，ConA 处理诱导的 CD8+ T 细胞群数量高出 2.8 倍，而 CysA 预注射仅诱导高出 1.5 倍。在ConA处理的小鼠中，CTL（GZMB+子集）占总CD8+T细胞的47.9%，分别比PBS处理和CysA+ConA处理的小鼠高6.5倍和2.2倍。尽管自然杀伤 T 细胞（NK-T 细胞）在 AIH 中也会产生 GZMB，但发现它们的数量比 CTL 低约 9 倍。此外，研究报道，NK-T 细胞中 GZMB 的表达低于 CTL。这些发现提供了证据，证明 CTL 是 AIH 中产生 GZMB 的主要群体。此外，CD8+ T 细胞的肝脏浸润不受 Q-SNAP 的影响。一致的是T细胞相关细胞因子。组织学研究表明，在 ConA 处理的肝脏中，正常肝小叶几乎消失，相比之下，在 PBS 和 CysA+ConA 处理的小鼠中可以清楚地观察到这一点。此外，ConA 治疗小鼠的血清 ALT 水平至少比其他两组高两倍。这些结果证实了过度活跃的 T 细胞与 AIH 之间的关系以及 CysA 的 T 细胞抑制作用。更重要的是，通过声余辉成像实时监测这些免疫事件，证实了 Q-SNAP 对 T 细胞介导的细胞免疫体内精确成像的可行性。此外，在声余辉成像后，PBS 处理的小鼠的这些器官中没有观察到组织学损伤，显示了其体内安全性。
结论
这项研究报告了第一个用于实时检测体内 T 细胞免疫激活的声余辉纳米探针。受益于 GZMB 触发的猝灭剂释放，Q-SNAP 介导的声余辉增强了 21.8 倍，LOD 低至 2.1 nm，使其与细胞毒性 T 细胞水平具有良好的相关性。使用实时无激励超声照射，超声余辉在所有成像深度上都优于 SBR 中的荧光，并且在体外仍然可以通过 4 厘米厚的组织（比荧光深四倍）进行检测。一致的是，声余辉可以从体内深层器官中的纳米探针重新充电，从而能够以最小的侵入性纵向检测小鼠 AIH 模型中的 T 细胞活性。 超声余辉早在注射探针 4 小时后即可区分肝炎和健康肝脏，SBR 高达 23.3，其灵敏度与报告肝损伤的临床血液 ALT 测试相当。这种智能探针也是评估预防性 CysA 治疗的有效指标，有望准确实时监测 T 细胞抑制，以便在临床情况下及时调整药物剂量。与荧光成像相比，声余辉成像具有极高的SBR和体内灵敏度，但它非常耗时——与荧光成像数百微秒的采集时间相比，需要几秒到几分钟的采集时间。为了克服这一限制，需要进一步优化声余辉纳米探针的配方，以提高能量收集和转换的效率。此外，肝炎模型利用肝脏作为纳米颗粒的天然清除器官的优势，实现了Q-SNAP的高摄取，而对于其他器官的疾病诊断，所需的Q-SNAP剂量有待进一步研究。
参考文献
Activatable Sonoafterglow Nanoprobes for T-Cell Imaging.Cheng Xu, Shasha He, Xin Wei, Jingsheng Huang, Mengke Xu, and Kanyi Pu*,Adv. Mater. 2023, 35, 2211651, https://doi.org/10.1002/adma.202211651
