内容提要
本研究报告近红外可激发有机余辉纳米颗粒(NOANPs)，利用单线态氧(1O2)能量转移，以最小的光漂白实现长时间的高强度发射。纳米颗粒集成了近红外光敏剂(NAM-0)和三烯蒽衍生物(TD)，前者在808 nm激光激发下产生丰富的1O2，后者作为余辉底物，将1O2转化为持续发光。通过一步纳米沉淀的共封装确保了NAM-0和TD之间的接近，实现了高效的能量转移，并在超低浓度(10 μg/ml)下产生出色的余光亮度(bbb109光子/s)。NOANPs通过近红外光与有机余辉化学的协同作用，实现了深层组织成像(离体深度达3.0厘米)。纳米颗粒独特地支持三种成像模式:荧光、白光激活的余辉和近红外触发的余辉，这些模式在胰腺癌和胶质瘤的原位小鼠模型中得到了验证。通过将近红外激发与有机余辉化学协同作用。
实验结果与讨论
近红外可激余辉纳米颗粒的设计与表征
我们设计了一个纳米平台，利用单线态氧能量转移来实现近红外驱动的余辉发光。该系统集成了两个功能组件:(a)富电子TD，作为余辉衬底合成，(b) NAM能够产生1作为光敏剂。通过1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)一步纳米沉淀将TD和NAM共包封成纳米颗粒，确保了组分之间的接近，实现了有效的能量传递。核磁共振谱(1HNMR)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)证实了TD的成功合成。而紫外-可见和荧光光谱显示在590 nm处有宽吸收峰，在635 nm处有发射峰，与它作为可见光余辉发射器的作用一致。
NAMs (NAM-0至NAM-6) 余辉引发剂的筛选
所有NAMs在四氢呋喃(THF)中表现出较强的近红外吸收[720 ~ 780nm];这些衍生物通过DSPE-PEG2000转化为水溶性纳米颗粒。纳米颗粒表现出红移吸收(Δλ = 15 ~ 100 nm;，增强了808 nm处的光子捕获，使其非常适合808 nm激光照射。通过DSPE-PEG2000将这些NAM和TD (TD:NAM = 100:100，μg:μg)共包封，得到了水动力直径为15 ~ 95 nm和球形形貌的水溶性纳米颗粒(表示为TD@NAM-NPs)。此外，这些纳米颗粒表现出典型的NAM(峰在800 nm左右)和TD(峰在590 nm)的吸收光谱筛选具有最佳余辉性能的纳米颗粒，研究余辉发光机理纳米粒子的余辉性能由三个关键因素决定: 1O2产生效率、1O2捕获能力和荧光量子产率。其中，产生1O2的能力对决定余辉强度起着重要作用。通过体内成像系统(IVIS)成像近红外激发后(808 nm, 50 mW/cm2，30 s)测量的余辉强度显示，TD@NAM-0-NPs表现最好，发射2.17×10-8光子/s，比最弱的候选光亮27.1倍。这种优势与NAM-0异常的1O2生成有关。通过单线态氧传感器绿色(SOSG)荧光和1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)降解试验验证。NAM-0-NPs的SOSG内过氧化物(EPO)形成速率最快(F/F0= 1.99)。辐照180-s后)和47%的DPBF降解效率(辐照100-s后)，证实了活性氧(ROS)的强劲生成。相比之下，TA@NAM-5和TA@NAM-4则表现出较差的1O2生成能力，这与它们微弱的余辉信号一致。TD发射(635 nm)和DsRed/Cy5.5探测通道(570 ~ 770 nm)之间的光谱对准最小化了信号损失，而纳米颗粒限制阻止了1O2的向外扩散。为了研究TD是如何捕获生成并形成发光物质，我们使用H₂O₂/Na₂MoO₄体系进行MALDI-TOF质谱分析。在TD和1O2之间检测到环加成产物对应的特征峰，表明形成了不稳定的epo。此外，与磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水或Na₂MoO₄单独相比，与1O2孵育的TD-NPs显着增强了发光。余辉机制由三个阶段组成:(a)在808 nm激光照射下，NAM的电子从基态(S)被激发到单重态(S1)，随后系统间交叉(ISC)到三重态(T1)。T1中的电子在返回基态的过程中释放能量并将周围的3O2转化为1O2。(b)通过环加成扩散到余辉衬底TD中形成epo。(c) epo发生O-O键裂解和分解，通过化学引发的电子交换发光(CIEEL)直接发射光子(570 ~ 770 nm)。
TD@NAM-0-NPs近红外触发余辉的合理优化
为了最大限度地提高TD@NAM-0-NPs在808 nm激发下的余辉性能，我们系统地优化了三个关键参数:NAM-0与td质量比、表面活性剂和表面活性剂与td质量比。NAM-0:TD比值直接决定了NAM-0产生的近红外驱动的1O2与随后被TD捕获产生余辉之间的平衡。在次优比例下(NAM-0:TD < 30:100)，1O - 2生成不足限制了发光强度，而过量的NAM-0 (NAM-0:TD > 30:100)可能导致聚集或自猝灭。最佳NAM-0/TD比为0.3 (NAM-0:TD = 30:100)时，峰值余辉强度为3×10-8。表面活性剂的选择对余辉亮度有深远的影响，因为它决定了纳米颗粒的分散和分子的堆积。包覆的纳米颗粒分别比苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)和pluronic - f127稳定的纳米颗粒性能好8倍和30倍。DSPE-PEG2000的长PEG链可能会提高水稳定性，防扩散损失，而PSMA的短链和F127的体积结构可能会阻碍NAM-0-TD的接近。进一步优化DSPE-PEG/TD比为70 (7 mg DSPE-PEG:0.1 mg TD)，可获得最大的余辉输出(3 ×10-8光子/s)。最后，我们确定了合成TD@NAM-0-NPs (NOANPs)的最佳比例参数(TD: 100 μg,NAM: 30 μg, DSPE-PEG: 7 mg)，并将其用于后续实验。常氧条件下与氮饱和条件下相比，余辉增强了400倍，这表明1O₂在能量传递级联中起着不可或缺的作用。TD- nps(单独TD)和NAM- nps(单独NAM)的对照实验显示，余辉可以忽略不计NOANPs <1%，强调了MAMA - td协同能量传递的必要性。NOANPs和NAM- nps之间的32,714倍的亮度差异进一步突出了TD捕获1O₂以产生epo并以可见光形式释放能量的独特能力。
溶液中NOANPs成像参数的合理优化
系统优化了NOANPs的激发参数。5 μg/ml NOANPs的余辉信号随着808 nm激光照射时间的增加而增强(0 ~ 100 s)，并在50 s时达到3.314×10-8光子/s(0.7倍100 s)，虽然延长激发(100 s)略微增强了强度(2.2倍于30s)，但50 s阈值最大限度地降低了潜在的光热损伤，同时确保了稳健的信号产生。同样，余辉强度随着激光功率的增加而增加(0.1至1.0W/cm2)，但选择实用的0.5 W/cm2设置以避免组织过热，同时达到峰值输出的70%。浓度依赖性研究揭示了纳米颗粒密度至与余辉强度之间的直接相关性，10 μg/ml产生异常的余辉亮度大于10- 916光子/秒(1.76 ×10-9光子/秒)。NOANPs在激发后30分钟内表现出持续的余辉发射，60分钟后衰减到3.5 ×10-6光子/秒。这种优异的持续余辉发射是由于DSPE-PEG2000矩阵中NAM-0和TD的空间限制，从而最大限度地减少1O2扩散损失。
组织中的深层组织成像
鸡胸组织穿透实验验证了NOANPs优于白光激活体系。由于808 nm激发下纳米颗粒的余比比值为0.1 (NAM-0:TD = 10:100)或2.0 (NAM-0:TD = 20:100)时的强度亮3倍。这种平衡确保了最大的能量传递效率，同时保持胶体稳定性。余辉发光特性，有利于增加组织穿透深度。为了验证提高的组织穿透深度，我们比较了白光激发、808 nm激发和荧光激发下的穿透深度。808 nm激发在3 cm处表现出明显的余辉信号。然而，白激发和荧光成像显示1.5 cm以上的背景信号。此，808 nm激发发出的余辉明显增强了组织穿透深度。由于余辉成像具有较高的成像SBR，我们进一步比较了它们的SBR。近红外(NIR)触发的余辉在3.0 cm处保持2.9的SBR，超过了白光诱导的余辉(SBR = 1.1)。这一优势源于808 nm激光在余辉采集过程中不存在自体荧光。利用近红外激活余辉对皮下肿瘤和深部组织原位肿瘤进行成像双波长策略(近红外激发/可见光发射)协同增强穿透深度。在体内应用之前，NOANPs在具有流体动力直径的生理缓冲液[PBS、Dulbecco改良Eagle 's培养基(DMEM)、RPMI中表现出了出色的稳定性. 在24小时内几乎保持不变。这种稳定性归因于DSPE-PEG2000涂层，确保了生物环境中的胶体完整性。此外，余辉和荧光信号在缓冲液中保持大致一致，强调了不同生物应用。2 '，7 ' -二氯荧光素双乙酸酯(DCFH-DA)和5,5 '，6,6 ' -四氯-1,1 '，3,3 ' -四乙基氨基碳氰碘化物(JC-1)染色共聚焦成像显示，虽然NOANPs在808nm激光照射下产生ROS，但它们不会引起明显的线粒体功能障碍.此外，细胞毒性实验显示，当NOANPs浓度高达200 μg/ml时，4T1细胞的存活率为>88%，证实了其良好的相容性，为其在体内的安全应用铺平了道路。由于良好的生物相容性，NOANPs在体内成像方面得到了进一步的验证。首先，我们研究了不同功率对发光的影响。健康小鼠皮下初始注射NOANPs，在808 nm激发下(0.1~ 1.0W/cm2)，验证了功率依赖性的余辉发射，反映了随功率增加而发光增强的液相趋势。接下来，我们进行了皮下肿瘤成像。得益于NOANPs近红外光激发的特性，808 nm激光(0.5W/cm2)触发的余辉在4T1荷瘤小鼠中表现出比白光余辉和荧光更高的SBR。这种优势源于近红外光的深穿透性和无自身荧光。使肿瘤的精确描绘成为可能。通过增强渗透性和滞留效应的时间依赖性积累，注射后2小时SBR达到80.8，突出了NOANPs动态监测肿瘤的能力。为了评估NOANPs的体内生物降解性，我们将纳米颗粒静脉注射到健康小鼠体内。在不同时间点记录主要器官的余辉信号。NOANP注射后2 h各主要脏器均观察到较强的余辉信号，余辉信号逐渐减弱在第20天降至背景水平，表明有效的体内生物降解,满足深层肿瘤检测的迫切需要，我们在原位胰腺癌和多形性胶质母细胞瘤(GBM)模型中评估了NOANPs的成像能力。采用胰腺原位植入Pan02细胞的方法建立小鼠胰腺癌模型，采用脑内植入C6细胞的方法建立小鼠GBM模型。1 ~ 2周后，收集不同小鼠模型的胰腺和脑组织，通过苏木精和伊红染色进行组织学验证，确认肿瘤病变的存在。在胰腺肿瘤模型中，静脉注射NOANPs 2 h后观察到明显的余辉和荧光信号，808 nm诱导的余辉在2 h时SBR达到26.4，高于白色余辉和荧光。对于具有挑战性的深层GBM, 2 h后也观察到明显的荧光和余辉信号，NOANPs 808 nm诱导余辉的SBR为48.38，高于白光和荧光。这些结果强调了该平台克服致密组织中光子衰减的能力，这是传统可见光系统的局限性。
结论
本工作通过近红外可激发化学与有机纳米颗粒设计的合理结合，建立了深层组织余辉成像的高性能平台。通过系统优化，成功合成了具有理想光物理性能的NOANPs。NOANPs通过协同两个关键特性克服了传统余辉材料的局限性:(a)近红外驱动激活(808 nm)增强组织穿透性;(b)1O₂介导的能量转移实现明亮发射。通过在DSPE-PEG2000基体中共封装近红外光敏剂(NAM-0)和三烯蒽余辉衬底(TD)，我们实现了邻近驱动的能量传递，同时抑制1O₂扩散损失，这是实现超亮发射和低光漂白的关键进展。
参考文献
Enhanced Near-Infrared-Excitable Organic Afterglow Nanoparticles for Deep-Tissue Multimodal Imaging via Singlet Oxygen-Mediated Energy Transfer，Yuzhen Yu , Zhe Li , Shiyi Liao, Baoli Yin, Qingpeng Zhang, Jiaqi Fu, Cheng Zhang* , Ying Zhou* , and Guosheng Song，Research 2025; 8: Article 0834，https://doi.org/10.34133/research.0834
