内容提要
荧光成像是现代生物学、肿瘤学和生物医学应用的重要工具。余辉发光(AGL)避开了实时激发源的光散射和组织自身荧光干扰，显着提高了成像灵敏度和成像深度。在这里，我们提出了一种设计和合成具有聚集诱导发射(AIE)效应的AGL纳米探针的方案，可以同时红移和放大余辉信号，用于肿瘤成像和图像引导肿瘤切除。该纳米探针(AGL AIE点)由烯醇醚形式的Schaap试剂和近红外AIE荧光剂(AIEgen)(四苯乙烯-苯基-二氰亚甲基- 4h -铬，TPE-Ph-DCM)组成，抑制非辐射耗散途径。用白光预照射AGL AIE点可以产生单线态氧，将Schaap试剂转化为1,2-二氧乙烷形式，从而初始化AGL过程。在AIEgen的辅助下，AGL同时显示出最大发射红移(从~540 nm到~625 nm)和强度增强(提高3.2倍)，从而获得更好的信背景比、成像灵敏度和成像深度。激活的AGL可以持续10天以上。与传统方法相比，我们的方法提供了一种新的解决方案，可以同时实现红移和放大余辉信号，从而获得更好的体内成像结果。
AIE纳米粒子的制备
聚集诱导发射(AIE)是指荧光团在分子状态下发出微弱的荧光，而在聚集形成时显示出极大增强的荧光。与传统平面荧光团在聚集状态下由于聚集引起的猝灭效应而表现出信号减少不同，AIE荧光团通常具有丰富的分子内转子，并具有三维扭曲的分子几何形状。它们的分子内运动在聚集体或固态中受到限制，从而抑制了非辐射衰变引起的激发态能量损失。此外，扭曲的几何结构还减少了AIE分子间在聚集状态下的相互作用(例如，π -π堆叠)，并进一步促进了AIE效应。在这方面，AIEgens允许开发具有丰富亮度的荧光纳米材料，特别是超亮纳米颗粒或纳米探针，其中数千个AIEgens被限制在有限的颗粒内微环境中。我们和其他人已经证明了超亮AIE纳米颗粒在细胞跟踪、肿瘤成像、血管成像等方面的优势，包括共聚焦成像、超分辨率成像、近红外成像、NIR- ii成像、多光子成像、余辉成像技术等。最近，我们报道了一种新的基于AIEgen的AGL纳米探针(AGL AIE dot)，它具有明亮和持久的近红外余辉信号，可用于体内敏感肿瘤成像和图像引导肿瘤切除。AGL AIE点由(1)Schaap剂(化合物1)作为余辉继电器单元组成;(2)近红外发射AIEgen四苯基乙烯-苯基二氰亚甲基4h -铬(TPE-Ph-DCM)作为单线态氧(1o2)发生器和最终余辉信号报告器;(3)生物相容性两亲共聚物1,2-二硬脂酰-snglycero-3- phospho乙醇胺- n -[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)作为包封基质。采用超声辅助纳米沉淀法，将含TPE-Ph-DCM、化合物1和DSPE-PEG2000的四氢呋喃(THF)溶液在超声下滴入去离子水中，制备AGL AIE点。超声有助于促进这些化合物向水相扩散，形成AGL AIE点成核核，并通过PEG链向外延伸到水相进一步稳定。使用Schaap代理的烯醚格式，它对于长期存储目的更稳定。使用前，用白光对AGL AIE点进行预照射，使TPE-Ph-DCM产生1o2。生成的1o2随后将Schaap试剂的烯醇醚形式氧化为1,2-二氧乙烷形式(化合物2，)。不稳定的Schaap 's 1,2-二氧乙烷剂缓慢产生激发态化合物，该激发态化合物将激发态能量传递回TPE-Ph-DCM，产生中心在~625 nm的近红外余辉信号。
与发射黄绿色的Schaap剂相比，AGL AIE点具有更长的发射波长(~625 nm比~540 nm)，更亮的余辉强度(增强3.2倍)和更长的发光持续时间(10天比4天)。在这方面，预照射的AGL AIE点具有改进的SBR灵敏度和组织成像深度，不仅优于AGL点，而且优于传统的近红外荧光成像技术。AGL AIE点与aiegen扩增近红外余辉信号的敏感性在腹膜癌小鼠模型中得到了很好的证实。经静脉注射入腹膜癌变小鼠后，经预照射的AGL AIE点由于其增强的渗透性和滞留作用而在肿瘤内积累。像大多数纳米探针一样，AGL AIE点不可避免地在其他器官中积聚，如肝脏。但由于各器官微环境的不同，AGL AIE点的余辉信号持续时间不同，一般在肿瘤中持续时间较长。因此，在灵敏的近红外余辉成像的辅助下，AGL AIE点可以清晰地照亮这些肿瘤结节，包括亚毫米结节。然而，增强的通透性和保留效应在肿瘤间的异质性可能会导致一小部分腹部肿瘤中预先照射的AGL AIE点不能有效进入，导致余辉信号变暗，使外科医生能够切除大部分但不是全部的微小肿瘤结节。
在本方案中，我们详细描述了TPE-Ph-DCM的化学合成和纳米沉淀法制备AGL AIE点。我们还描述了红移和放大的余辉信号的验证，以及AGL AIE点在肿瘤的敏感余辉成像和余辉图像引导肿瘤切除中的应用。该程序针对6周龄雌性BALB/c小鼠进行了优化;然而，在成功建立肿瘤模型后，在其他小鼠品系上也应得到类似的结果。我们预计，经过特定的修改，具有高且持久的近红外AGL以及最小背景干扰等优点的AGL AIE点也可以应用于本协议范围之外的其他成像应用。
与其他方法比较
荧光成像具有高灵敏度和高时空信息，是一种可视化或感知生物标本中特定分子或过程的有效方法。然而，传统的近红外荧光成像面临着一些缺点，如穿透深度差和与实时外部光照射相关的自身荧光干扰。开发NIR-II荧光团在减少这种自身荧光干扰方面显示出巨大的潜力，并且在体内成像和图像引导手术中具有良好的性能。然而，它只能减少而不能消除这种干扰。另外，利用脉冲激光将低能光子上转换为短波长的多光子成像技术也证明了成像深度和灵敏度的提高。然而，多光子激发作为一个非线性光学过程，存在严重的光衰减。此外，多光子成像的扫描面积小和可见发射也阻碍了其在大组织制图和图像引导肿瘤切除手术中的应用。另一方面，磷光成像在停止激发源后通过延迟信号采集消除了组织自身荧光干扰，但由于磷光寿命短，需要原位光激发，穿透深度较差。
AAGL成像不需要将激发光源应用于人体，因为探针可以预先激活，从而避免了这些缺点，并且进一步提高了SBR，成像灵敏度和深度。延长余辉波长和增强余辉强度是研制成功AGL探测器的关键。已经报道了许多策略来将Schaap 's二氧乙烷基试剂的发射红移到近红外区域，但很少有策略可以表明近红外发射的试剂比其黄绿色发射的衍生物更亮。在这个方案中，我们开发了一个近红外发射的AIEgen，与Schaap试剂形成一个CRET对，将AGL从可见光区域扩展到近红外窗口，它也比供体绿色发射Schaap试剂本身表现出更高的余辉信号51,56。值得注意的是，AGL AIE点的持久近红外AGL也为肿瘤的可视化和术中图像引导的肿瘤切除术提供了足够的时间窗口。与分子内CRET和共轭长度延长方法相比，AGL给体和AIE近红外受体的组装操作方便，供受体比可调，易于选择不同的Schaap给体和AIE受体来调节余辉信号波长。在本协议中，我们优化了以DSPE-PEG2000为封装矩阵的AGL AIE点形成过程。其他生物相容性聚合物，如Pluronic F127，聚(乳酸-羟基乙酸)，也可用于特定优化后获得类似的结果。此外，纳米探针配方不会影响它们对特定分子(如炎症生物标志物过氧亚硝酸盐)的反应性，并且AGL56、57和AGL AIE点的激活在体内监测和定位感兴趣的分子方面也具有很大的潜力。此外，使用Schaap试剂的烯醇醚前体(而不是其氧化产物)构建AGL AIE点，也允许2周以上的长期储存，并且可以方便地与预辐照一起使用。
我们的策略最重要的贡献是我们提出了一种纳米工程方法，通过将AIE效应引入系统来放大Schaap试剂的近红外AGL。在体内成像需要具有足够π共轭长度的光学探针进行近红外发射，但π共轭长度的增加通常会导致发光强度的降低。
当发射波长发生红移时，传统的CRET分子或纳米粒子的余辉强度会降低。我们的策略是一个通用的车辆纳米平台系统，它很容易地将这些现有的可活化Schaap试剂从可见光区转化为近红外区，甚至具有放大的余辉信号的NIR- I或NIR- II区，只需用具有优异的NIR- I或NIR- II发射的AIEgens取代TPEPh-DCM。这种纳米平台也很容易复制、调整或修改，以构建不同目的的不同探针。此外，它们的多种功能可以很容易地扩展;例如，可以简单地将大量不同的靶向和功能基团引入纳米探针表面，以便特定地递送到感兴趣的目标。
AIE纳米粒子的应用
荧光成像有助于了解细胞动力学和生物过程，是最直接的可视化工具，可实现术中实时图像引导的肿瘤手术。在这些可用的成像技术中，余辉成像绕过了与实时外部光激发相关的组织自身荧光，从而在SBR和成像深度方面显示出优势。在我们的方案中，我们引入扭曲的AIEgens与Schaap试剂形成CRET对，同时红移和放大余辉信号。AGL AIE点具有显著的持久余辉信号，具有良好的成像灵敏度和成像深度，是实时活体成像的有力工具。我们已经证明，AGL AIE点可以应用于敏感的余辉肿瘤成像，这大大优于AGL AIE点的相应荧光成像。这些AGL AIE点提供了非常高的肿瘤-肝脏余辉信号比，达到34.2，这是其他纳米探针几乎没有达到的。如此高的肿瘤和肝脏信噪比，有利于AGL AIE点在肝脏肿瘤诊断中的应用，也有可能用于图像引导下的肿瘤切除。我们还表明，AGL AIE点能够在腹膜癌小鼠模型中精确切除尺寸小于1mm的微小肿瘤结节。
鉴于荧光成像已广泛应用于诊断和药物递送监测，我们也预计特异性修饰的AGL AIE点(具有高且持久的近红外AGL以及最小背景干扰的优点)也可用于精确监测疾病进展，分析生物分子或过程，检测和识别疾病制造者等。例如，通过对Schaap试剂进行特异性活化修饰，我们开发出了过氧亚硝酸盐应答AGL AIE点，用于了解中性粒细胞参与的过程，如急性炎症、过敏和免疫原性细胞死亡。未来，如果AIEgens和Schaap的代理库建立起来，AGL AIE点纳米平台的应用范围将不断扩大。在本方案中，我们完善和规范了AGL AIE点的制备步骤和扩增余辉信号的验证，对生物学、肿瘤学、生物医学、分子成像探针和癌症免疫治疗感兴趣的科学家、临床医生和成像专家有价值。
方法的局限性
在这个方案中，我们已经证明了AGL AIE点与它们的Schaap剂前体相比同时表现出红移和放大的余辉信号。他们允许超高SBR的敏感肿瘤成像，明显优于传统的荧光成像，并允许精确的图像引导肿瘤切除。然而，由于这些近红外余辉信号的穿透深度较差，报道的AGL AIE点在进一步深层组织成像中的应用仍然受到限制。设计明亮的NIR- II AIEgens和相应的AGL AIE点可以规避这一限制，其中需要具有大Stokes位移的NIR- II AIEgens或顺序的CRET对(NIR到NIR- II可见)，以确保Schaap试剂和NIR- IIAIEgens之间的光谱重叠，以促进有效的CRET过程。此外，将发射波长进一步红移至NIR-II区域可能会导致余辉信号强度降低。因此，当不能满足更长的波长和更高的余辉信号时，需要在余辉信号的波长和亮度之间找到平衡，以保证高成像分辨率。另一方面，通过超声辅助纳米沉淀法制备AGL AIE点。虽然我们已经证明了它的适用性和可重复性，可以用各种氟化物和试剂合成水稳定的纳米颗粒，但人类活动的大量参与可能导致批次之间的差异。解决这一问题的一种方法是使用自动或半自动合成方法，如微流控芯片，以减少批量变化，增加合成规模，以方便未来的转化研究。
总结
在这里，我们描述了基于Schaap试剂和AIEgens的AGL AIE点的一步一步合成，并提供了验证放大的近红外余辉信号和应用AGL AIE点进行敏感肿瘤成像和图像引导肿瘤切除的详细步骤。
1. 设计和合成AIEgen, TPE-Ph-DCM(步骤1-10)。著名的烯醇醚形式的Schaap试剂(化合物1)的合成已经在以前的报告中得到了很好的研究和提供。AIEgen的设计是该协议的关键特点。它是专门为满足以下要求而设计的:(i)吸收带与Schaap剂的发射带相匹配，形成有效的CRET对;(ii)足够的π共轭长度将发射延伸到近红外区域(TPE-Ph-DCM在THF/水混合物(vol/vol = 1:9)中的发射峰以~640 nm为中心，发射尾延伸到~850 nm(步骤11-16));(iii)具有AIE特征的扭曲分子几何结构，保证了聚集体的高发射亮度(聚集体中TPE-Ph-DCM的荧光显著增强，比纯THF溶液高约14.0倍);(iv)在使用前将烯醇醚前体氧化成Schaap 's 1,2-二氧乙烷格式的1O2生成能力(TPE-Ph-DCM显示比商用高性能光敏剂Rose Bengal更高的1O2生成能力(步骤17-21));(v)具有一定的疏水性，被生物相容性基质包裹形成AGL AIE点。
2. 一步一步制备AGL AIE点(步骤22-36)。采用改进的纳米沉淀法制备AGL AIE点，以DSPE-PEG2000共聚物为基体，将化合物1和TPE-Ph-DCM共包封在同一个AGL AIE点63中(图2b)。在AGL AIE点形成过程中，DSPE-PEG2000的疏水段会与化合物1和TPE-Ph-DCM相互缠绕形成疏水核，而PEG链会向外延伸至水相以稳定这些AGL AIE点。通过这种纳米探针的形成，成千上万的TPE-Ph-DCM和化合物1分子被限制在纳米颗粒内微环境中。紧密的分子填充保证了TPE-Ph-DCM在AGL AIE点中的高亮度和高效的单线态产氧。这种接近性保证了TPE-Ph-DCM生成的单线态氧能够快速有效地氧化化合物1，初始化化学发光过程，也使得Schaap 's 1,2-二氧乙烷与TPE-Ph-DCM之间的高效CRET过程能够发射近红外AGL。研究了AGL AIE圆点的尺寸、形态和稳定性(步骤37-48)，在均匀的球形形态下，AGL AIE圆点的平均水动力直径为~95 nm。白光照射不影响其粒径分布，连续监测7天，胶体稳定性良好，粒径几乎没有变化。
3. 体外验证aiogen扩增的余辉信号(步骤49-80)。使用前，对TPE-Ph-DCM进行外部白光照射，生成1o2，将化合物1从烯醇醚形式氧化为4元1,2-二氧乙烷形式。1,2-二氧乙烷剂不稳定，同时形成电子激发态苯甲酸酯，将激发态能量转移到TPE-Ph-DCM，得到近红外AGL。优化了化合物1与TPE-Ph-DCM的比例、预辐照时间和功率，以获得最佳的AGL信号。该策略不仅成功地将AGL从绿色区域红移到近红外区域，而且在AIEgen的辅助下，将纯AGL剂的AGL强度进一步放大3.2倍，提高了成像分辨率和成像质量。有趣的是，AGL AIE点的近红外AGL持续时间至少为10天，明显优于AGL点(AGL点的AGL持续时间为4天)。
4.肿瘤的余辉成像和余辉图像引导下的肿瘤切除(步骤81-113)。通过腹腔注射4T1癌细胞建立腹膜癌小鼠模型(补充资料)。将预照射后的AGL AIE点静脉注射，通过活体成像系统(IVIS)获取预先指定时间的荧光和余辉成像，用于肿瘤的可视化和成像(步骤81-95)。然后依次在无和有余辉成像引导的情况下进行肿瘤切除(步骤96-113)。
参考文献
Preparation of AIEgen-based near-infrared afterglow luminescence nanoprobes for tumor imaging and image-guided tumor resection， Chao Chen , Xiaoyan Zhang , Zhiyuan Gao , Guangxue Feng* & Dan Ding*，Nat. Protoc.,https://doi.org/10.1038/s41596-024-00990-4
