内容提要
本研究介绍了两种硼二吡咯甲烷（BDP）衍生物（2H-BDPI 和 H-BDPI）的合成及表征，这些衍生物具有不同的光物理性能，可用于增强fPDT。2H-BDPI 和 H-BDPI 展现出独特的余辉性能，使照射后持续产生活性氧（ROS）。这些具余辉能力的衍生物在分段照射下表现出更高的效率，归因于余辉介导的能量转移延长了ROS的产生。在体外CT26癌细胞实验中，经过优化的fPDT条件下显示出显著的光毒性和增强的ROS生成。针对金黄色葡萄球菌的抗菌实验显示，分段照射能够有效抑制生物膜形成。在肿瘤小鼠体内的余辉成像中，显示出高对比度信号及良好的生物相容性。
结果与讨论
BDP衍生物的制备与活性氧（ROS）的生成
H-BDPI、H-BDPI 和 M-BDPI 的合成是通过多步反应实现的。BDPI 在哌啶和醋酸的催化下与 4-(羟甲基)苯甲醛反应。我们测得了2H-BDPI、H-BDPI和M-BDPI在DMSO溶液中的吸收和发射光谱特性。这些结构相关的化合物表现出不同的光物理特性，其中2H-BDPI的吸收和发射最大值分别为590 nm和619 nm，H-BDPI则显示出红移特征，吸收峰在640 nm，发射峰在678 nm，而M-BDPI则表现出相对蓝移的跃迁，吸收峰在540 nm，发射峰在573 nm。在光照射下，BDP 衍生物与环境氧反应生成ROS，从而对肿瘤细胞或细菌造成氧化损伤，最终导致细胞死亡。根据我们之前的研究，2H-BDPI 中仅有一个双键在照射后经历氧化断裂以参与 ROS 的生成。由于 2H-BDPI 和 H-BDPI 在不同的照射条件下进行评估，特别是采用了不同的光源和功率密度，本研究仅比较了三种 BDP 衍生物在各自的连续照射和分段照射条件下的 ROS 生成效率。使用 1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为探针，在传统光动力疗法（PDT）和分段光动力疗法（fPDT）中评估了 2H-BDPI、H-BDPI 和 M-BDPI 的 ROS 生成效率。ROS 与 DPBF 的作用会使其形成过氧化物，随后分解为无色的 1,2-二苯基苯，从而降低 417 nm 处的吸收强度。2H-BDPI在连续照射组（一次性照射160秒）和分次照射组（一次性照射20秒，共8次，每次照射间隔3分钟）中，DPBF吸光度均随着光照时间的增加而逐渐下降，这归因于ROS的生成。相比之下，在没有2H-BDPI的情况下，DPBF吸光度几乎没有变化。值得注意的是，分次照射组的DPBF吸光度下降更为显著，这表明2H-BDPI在分次照射下具有增强的光动力活性。这种增强归因于2H-BDPI的余辉性能，它允许在暗间隔期间氧气重新积累，并通过其发出的光持续生成ROS，大大延长了ROS的生成时间。同样，具有余辉性能的H-BDPI在分次照射下比在连续照射下表现出更明显的DPBF吸光度下降，进一步证明余辉能够增强分次光动力活性。为了清除产生的特定类型活性氧，我们使用9,10-蒽二丙酸（ABDA）和二氢罗丹明123（DHR123）分别监测单线态氧（¹O₂）和超氧阴离子的生成。在BDP衍生物处理后再进行光照，ABDA的吸收峰显著下降，证实了¹O₂的产生。其中，具有余辉特性的2H-BDPI和H-BDPI在间歇照射下比连续照射下显示出更高的¹O₂生成效率。此外，我们观察到在对BDP衍生物进行照射后，DHR123在550 nm的荧光强度增加，表明这些衍生物在光照下能够产生一定量的O₂•-。具体而言，2H-BDPI和H-BDPI在间歇照射下550 nm荧光强度的变化明显高于连续照射条件下的变化。以亚甲蓝（MB）作为参考，通过DPBF吸收变化评估了ROS生成的效率，并比较了2H-BDPI与MB的ROS生成能力。DPBF分别加入到100 nM的2H-BDPI或MB溶液中。混合溶液在635 nm激光（0.2 W/cm²）照射下进行光照，2H-BDPI照射160秒（每20秒测量一次吸收光谱），MB照射40秒（每5秒测量一次吸收光谱）。与MB相比，2H-BDPI的ROS量子产率计算为68.24%。
2H-BDPI 和 H-BDPI 的余辉成像
2H-BDPI 和 H-BDPI 在光照下从基态 (S₀) 激发到激发单重态 (S₁)。随后，它们经历系间跃迁 (ISC) 到激发三重态 (T₁)，在此过程中发生电子转移生成 O₂•⁻。O₂•⁻ 适度氧化光敏剂的芳基乙烯基团，形成高能的 1,2-二氧环丁烷中间体。该中间体不稳定，通过断裂 O–O 键分解，释放能量并在光停止照射后形成相应的醛。在此过程中，释放的化学能量被回传到光敏剂，使其重新激发并通过余辉弛豫至 S₀，从而在黑暗中持续生成 ROS。在635 nm激光照射下，2H-BDPI会发出明亮的近红外（NIR）光。 采用IVIS成像系统捕获了2H-BDPI的明场、余辉和荧光图像。当25 μM的2H-BDPI在635 nm激光照射下5分钟时，表现出明显的余辉，其持续时间可达80分钟。随后，我们系统地探讨了2H-BDPI的浓度、激光照射时间和激光功率密度对余辉强度的影响。首先，将不同浓度的2H-BDPI在功率密度为0.8 W/cm²下照射5分钟。结果表明，余辉强度随2H-BDPI浓度的增加而增加，从而确认余辉强度与2H-BDPI浓度之间存在直接关系。接着，将25 μM的2H-BDPI暴露于不同时间（0.8 W/cm²）的激光照射下。余辉强度随照射时间的增加而上升，直到5分钟后开始下降，这表明最优照射时间为5分钟。最后，将25 μM的2H-BDPI在不同功率密度（0.1至1.6 W/cm²）下照射5分钟。结果显示，余辉强度随功率密度的增加而显著增加，表明余辉强度依赖于激光功率密度。
在橙色 LED 光（18 mW cm-2）照射下，使用 IVIS 成像系统获得了 H-BDPI 的明场、余辉和荧光图像。25 μM H-BDPI 在光照 30 秒内显示出明亮的余辉，并且余辉持续时间可达 60 分钟。为了进一步阐明 H-BDPI 的余辉特性，我们探讨了其浓度和照射时间对余辉强度的影响。随着 H-BDPI 浓度的增加，余辉强度显著上升，与 2H-BDPI 相同。
2H-BDPI 和 H-BDPI 的细胞内余辉成像
为了系统评估2H-BDPI和H-BDPI的细胞内余辉，我们使用小鼠结直肠癌细胞（CT26）进行了系列细胞成像实验。将CT26细胞与200 μM 2H-BDPI共培养8小时后，在635 nm激光照射（0.6 W/cm²，1分钟）后仍表现出持续超过9分钟的余辉信号。这一延长的发光特性表明，即使光照停止后，2H-BDPI仍能持续产生ROS，凸显其在持续成像应用中的潜力。为了优化2H-BDPI的余辉性能，我们在细胞水平系统地研究了三个关键参数：（1）浓度：浓度依赖性研究（0–200 μM）表明，在固定照射条件下（0.6 W/cm²，1分钟），随着2H-BDPI浓度的增加，余辉强度显著增强。（2）照射时间：时间依赖性分析显示，余辉强度在照射1分钟时达到最大，随后逐渐下降，提示在此时间范围内能量积累达到最佳。（3）功率密度：对激光功率（0–0.8 W/cm²）的系统评估确定0.6 W/cm²为实现最大余辉强度的最佳激发密度。在与 H-BDPI 的平行研究中，需要不同的激活参数。将 CT26 细胞与 125 μM H-BDPI 共孵育 8 小时后，经 12 分钟橙色 LED 照射（18 mW cm²）后，显示出明亮的延迟发光，并可持续 9 分钟。浓度反应实验显示，在固定照射条件下，H-BDPI 浓度（0–125 μM）与延迟发光强度呈线性关系。值得注意的是，时间优化研究表明，12 分钟的照射可产生最大延迟发光强度，这与 2H-BDPI 观察到的较短最佳照射时间形成对比。
细胞内活性氧生成与细胞毒性
我们随后通过使用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）法评估了fPDT的抗肿瘤效果。在缺光条件下，所有CT26细胞的存活率接近100%，这证实了BDP衍生物优异的细胞相容性。在激光照射5分钟后，这些衍生物对CT26细胞表现出浓度依赖的光毒性。值得注意的是，具有余辉性能的BDP衍生物在分段照射下比在连续照射下显示出更好的抗癌效果。例如，40 nM的2H-BDPI在分段照射组（每次照射50秒，共6次，每次照射间隔3分钟）诱导了显著的细胞死亡，而连续照射组（一次性照射5分钟）的细胞存活率维持在56%。类似地，120 nM的H-BDPI也显示出可比结果。相比之下，缺乏余辉性能的M-BDPI在分段和连续照射下的细胞存活率没有显著差异。这些发现强调了余辉性能在提高BDP衍生物fPDT抗肿瘤效果中的关键作用。为了评估BDP衍生物的细胞内ROS生成能力，我们采用了荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）。该探针可被细胞内酯酶水解为无荧光的DCFH，然后被ROS氧化为荧光的DCF。在与CT26细胞共孵育后，具有余辉性能的2H-BDPI和H-BDPI在间歇照射条件下（每次50秒，共6次，每次照射间隔3分钟）的绿色荧光强度明显高于连续照射条件（一次5分钟）。相比之下，不具余辉性能的M-BDPI在间歇照射和连续照射下的绿色荧光强度无显著差异。这表明具有余辉性能的BDP衍生物在间歇照射下能够产生更多的ROS。我们进一步使用ImageJ软件对荧光强度进行了定量分析。2H-BDPI和H-BDPI在间歇照射下的ROS生成分别比连续照射高1.57倍和1.49倍。而M-BDPI在两组之间的ROS生成无显著差异。这些发现突显了余辉性能在增强fPDT抗肿瘤效果中的重要作用。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像进一步证实了这些发现。我们使用Calcein-AM/碘化丙啶（PI）双重染色评估了BDP衍生物对CT26细胞的光毒性作用。CT26细胞在黑暗中仅显示绿色荧光，表明BDP衍生物在无光照的情况下对癌细胞没有杀伤作用。然而，在分段照射（每次50秒，共6次，每次照射间隔3分钟）下，与细胞共同孵育的2H-BDPI和H-BDPI显示出显著增强的红色荧光，相较于连续照射（每次5分钟）更为明显。相比之下，M-BDPI在分段照射与连续照射之间的红色荧光强度没有显著差异。总体而言，2H-BDPI和H-BDPI的余辉性能使其在暗期能够重新积累氧气并持续产生ROS，导致更严重的光动力损伤并诱导癌细胞死亡。与传统的连续照射相比，这种分段照射策略显著增强了光动力疗法（PDT）的效果。
体外抗菌活性测定
我们进一步通过使用金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）评估了BDP衍生物在分次光动力治疗（fPDT）中的抗菌效果。随着BDP衍生物浓度的增加，S. aureus的存活率显著下降。值得注意的是，具有余辉性能的光敏剂在分次照射（每次1分钟，共10次，每次照射间隔3分钟）下显示出优于连续照射（一次10分钟）的抗菌效果。例如，2H-BDPI在分次照射下的最低抑菌浓度（MIC）为60 nM，而在连续照射下为90 nM。同样，H-BDPI在分次照射下的MIC为60 nM，显著低于连续照射所需的120 nM。相比之下，缺乏余辉性能的M-BDPI在分次照射和连续照射下的MIC无显著差异。这些结果表明，BDP衍生物的余辉性能能够在fPDT中增强抗菌活性。然而，在相同条件下，BDP衍生物对E. coli并未表现出明显的抗菌活性，这表明这些衍生物具有选择性靶向革兰氏阳性菌的能力。我们使用结晶紫（CV）染色来评估BDP衍生物抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的能力。所有经照射处理的BDP衍生物均表现出抑制生物膜形成的能力，其中2H-BDPI和H-BDPI在分段照射下效果更为显著。具体来说，24 μM的H-BDPI在分段照射下的生物膜抑制率高于连续照射。然而，当浓度升至48 μM时，两组的抑制效果趋于相似，这可能是由于橙色LED光的功率密度不足，无法完全抑制生物膜形成。相比之下，M-BDPI在分段照射与连续照射下的生物膜抑制效果差异不明显。在暗处条件下，BDP衍生物对生物膜形成影响甚微。相反，在光照条件下，随BDP浓度升高，生物膜残留量减少，染色强度也减弱。值得注意的是，对于3 μM的2H-BDPI和24 μM的H-BDPI，分段照射下的紫色强度明显低于连续照射，突出显示了它们在抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成方面的优越能力。
结论
本研究表明具备余辉能力的2H-BDPI和H-BDPI通过二氧环介导的化学激发，在黑暗间歇期间实现持续的ROS生成和氧气恢复，从而显著增强光动力治疗（fPDT）的疗效。结构改性优化了其光物理性质，实现了可调节的吸收/发射特性（540–678 nm）和高对比度余辉成像（2H-BDPI信号噪比为9.7），在肿瘤可视化方面优于传统荧光。分段照射可增强抗癌效果及针对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。与此同时，缺乏余辉的M-BDPI未显示类似提升，进一步凸显了余辉在克服光动力治疗局限（如氧气供应不足和短暂ROS生成）中的关键作用。2H-BDPI、H-BDPI和M-BDPI在低氧条件下可以生成少量O2•⁻，从而略微缓解对氧气的高度依赖。
参考文献
Afterglow-enhanced fractionated photodynamic therapy for antitumor and antibacterial applications，Xinxin Xu，Zhigang Xie，Min Zheng，Chem. Eng. J， 524 (2025) 168854，https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.168854
