内容提要
本研究报告由氯自由基（·Cl）驱动的不依赖于氧的余辉机制。采用纳米沉淀法制备了Hcy@AgCl-PEG，表面修饰AgCl异质结构，并以甲氧基聚乙二醇为稳定剂进行光活化·Cl生成。辐照后，AgCl产生·Cl，它加成到染料的共轭双键上，形成亚稳定的环氧化物中间体;随后的环氧化物分解释放出储存的化学能，重新激发染料并产生强烈的余辉发射。在体内，Hcy@AgCl-PEG实现了高对比度的肿瘤成像，并利用·Cl的氧化效能通过氧化应激和DNA单电子氧化诱导显著的光动力学治疗。
结果和讨论
氯自由基驱动的余辉纳米粒子的制备及其发光性能
我们设计了一个不依赖于氧的余辉系统，它是以半花菁染料为核心，AgCl作为氯离子（·Cl）发生剂，PEG作为胶体稳定剂首先，通过半花菁（E）-2-（2-甲氧基苯基）-2-（2-甲氧基（2-（9-（2-羧基苯基）-6-甲基-IH-吡唑-4-基）-2-氧代-1H-吡唑-4-基）氨基甲酸叔丁酯（二乙基氨基）2，3-二氢-1H-咕吨-4-基）乙烯基）-1-乙基-3，3-二甲基-3-吲哚-1-鎓（Hcy）（苯乙烯-共-马来酸酐）（PSMA）和1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基[聚乙二醇]（DSPE-PEG 2000）作为表面活性剂-用Na2CO3水解PSMA的马来酸酐基团产生表面羧酸盐以结合Ag+随后加入AgNO3，然后加入NaCl，将AgCl纳米颗粒沉积到Hcy核上。最后，我们接枝甲氧基聚乙二醇胺（PEG-NH2）以提供具有增强的生物相容性和胶体稳定性的Hcy@AgCl-PEG。
为了使余辉发射最大化，我们优化了未聚乙二醇化的Hcy@AgCl的三个关键参数：1）PSMA和DSPE-PEG 2000的质量比，2）Hcy负载量，和3）AgCl量。产生了最强的余辉信号，这是由于AgCl锚定增加了表面羧基密度。在固定的表面活性剂组成下，余辉强度随Hcy含量增加至157.1 µM;超过此点，自猝灭减少发射。AgCl变化（Ag+基础）显示峰强度为2.78 mM，尽管胶体稳定性有利于后续研究的1.39 mM在这些条件下，优化的Hcy@AgCl余辉强度比Hcy NPs的余辉强度高约40倍，并且在不同的采集时间保持信号强度，证明了Hcy@AgCl的稳定性和可靠性。Hcy@AgCl-PEG的余辉发光强度与常见的余辉发光材料，包括MEHPPVNPs、PFODBT。NPs和Ce6 NPs，表明其适用于体内成像。Hcy@AgCl-PEG纳米颗粒具有可调亮度、长余辉和优异的光稳定性，这些属性使它们成为高对比度体内成像和治疗诊断应用的有希望的候选者。
氯自由基驱动的余辉及其与氯自由基产率的关系
为了验证·Cl在Hcy@AgCl-PEG的余辉发光过程中的重要作用，我们进一步研究了余辉发光强度与·Cl之间的关系。为了证实·Cl而不是自由离子驱动Hcy@AgCl-PEG的余辉，我们首先比较了Hcy@AgCl-PEG的发光强度，。同型半胱氨酸纳米颗粒与等摩尔量的Cl-、Ag+或AgCl混合后，在相同的光照射下发光。只有含有AgCl的样品显示出余辉强度的显著增加，排除了自由Cl-或Ag+的直接贡献，并暗示了光下AgCl-Hcy相互作用。我们改变Hcy@AgClPEG的浓度，并记录余辉发射和·Cl浓度，通过N，N-二乙基对苯二胺（DPD）标准方法测量，其在与游离氯反应时产生515/553 nm的Wurster染料吸光度随着纳米颗粒浓度的增加，DPD信号和余辉强度同时上升，表现出很强的线性相关性。(R2= 0.973;类似地，延长光照射时间以高相关性（R2 = 0.967）提高·Cl产生（通过553 nm DPD峰监测）和余辉强度。这些研究表明光诱导·Cl生成是余辉所必需的，余辉强度与·Cl产率直接成比例，该过程不依赖于氧，但对pH敏感。
氯自由基驱动的余辉机理及Hcy相变的研究
为了阐明Hcy@AgCl-PEG的余辉发光机理，我们首先监测了Hcy@AgCl-PEG中Hcy在光照下的变化，随着光照时间的增加，Hcy在710 nm处的特征吸收峰逐渐减小，而在415 nm处的吸收峰逐渐增大同时，虽然荧光强度减小，但最大发射波长没有显著变化照射2 min后，Hcy在710 nm处的特征吸收峰显著降低，在415 nm处的新峰增加平行地，在750 nm处的荧光发射显著降低。一种新的发色团，将Hcy分解与余辉信号联系起来。基于这些数据，我们提出：1）光激发AgCl异质结构，产生电子-空穴对;空穴将Cl−氧化为·Cl。·Cl部分水解为HClO，其通过Hcy的C → C键加成形成亚稳态的内过氧化物中间体，该内过氧化物中间体储存化学能。酮产物释放储存的能量，重新激发Hcy并产生延迟光子发射。
氯自由基驱动余辉纳米粒子的非氧依赖余辉成像性能
在确定了Hcy@AgCl-PEG的余辉强度基本上与溶解氧无关后，我们直接将其发光性能与五种有代表性的有机余辉体系卟啉进行了比较（二氢卟酚e6，Ce6），一种三蒽衍生物（TA，6，7，15，16-四丁氧基-9，18-二均三甲苯基-5，8，14，17-四甲氧基苯并[rst]菲并[10，1，2-cde]五芬），半导体聚合物MEHPPV和PFODBT，传统的余辉发光依赖于1 O2或相关的ROS，使得这些材料在缺氧环境中易于急剧淬灭。氧消耗显著影响余辉发光强度。这种现象也发生在低浓度MEHPPV下。同样，在缺氧肿瘤中，MEHPPV的余辉发光强度随着循环次数的增加而降低，而其荧光强度几乎保持不变。为了测试这一点，将Ce6、TA、MEHPPV和PFODBT转化成水溶性纳米颗粒通过使用DSPE-PEG 2000的纳米沉淀法制备（Ce 6 NP、TA NP、MEHPPV NP和PFODBT NP），并将Hcy溶解在10%N，N二甲基甲酰胺（DMF）和50 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。它们的吸收光谱（300- 700 nm），荧光光谱（550-800 nm），和动态光散射（20-35 nm）证实了成功的NP形成。然后，我们使用溶解氧计通过氩气泵送调节并记录溶液O2水平，从空气饱和水开始（7.7 ppm O2），2 s的泵送将O2降低至5.3 ppm;在每种O2浓度下，在50 mL烧瓶中将2 mL等份的相应余辉探针脱气，取100 µL样品进行余辉测量。正如所预期的，Ce 6 NPs、TA NPs、MEHPPV NPs、PFODBT NPs和Hcy的余辉强度随着O2的降低而稳定地下降，在1.36 ppm处失去了超过70%的信号引人注目的是，Hcy@AgClPEG保留了几乎完全的发射这些数据明确表明，即使在1.36 ppm下，·Cl-驱动的余辉机制避免了氧依赖性，并在缺氧条件下保持明亮、高对比度的发光。
氯自由基驱动的光动力学疗法的体外研究
受光照射下高·Cl产率的启发，我们评估了Hcy@AgCl-PEG作为肿瘤靶向光动力剂。我们首先使用荧光探针2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFHDA）探测4 T1细胞中的ROS产生。只有Hcy@AgCl-PEG +白色光组显示出强烈的绿色荧光，证实光激活的·Cl触发了大量的细胞内氧化应激。为了验证·Cl介导的DNA损伤，我们对磷酸化组蛋白H2 AX（γ -H2 AX）进行了免疫荧光染色，这是一种公认的DNA双链断裂标志物。Hcy@AgCl-PEG和白色光照射显示出明亮的核γ -H2 AX灶，而对照组（PBS，单独的光，或没有光的Hcy@AgCl-PEG）显示出最小的染色。式细胞仪分析证实，这些氧化损伤和DNA损伤会转化为细胞凋亡。在没有光照的情况下，Hcy@AgCl-PEG仅诱导3.5%的细胞凋亡;白色光照射10分钟后（10 mW cm−2），凋亡增加至16.4%通过比较，Hcy NP+白色光相对于PBS对照（2.2%）触发了细胞凋亡（8.0%），反映了单独的Hcy产生的有限的ROS。为了量化光动力学细胞毒性，将4 T1细胞与增加的Ag当量浓度的Hcy@AgCl-PEG（0-4 µg mL−1）孵育4 h，照射10 min（白色光，10 mW cm−2），然后培养20 h。 MTT试验显示存活率呈剂量依赖性降低，在4 µg mL−1 Ag时仅达到20%的存活率。 未照射的细胞基本上保持活力，这强调了Hcy@AgCl-PEG的光触发特异性。相应的未修饰AgCl的Hcy NPs没有显示出明显的光毒性。这表明Hcy@AgCl-PEG的光毒性来源于AgCl照射后产生的·Cl，而不是Hcy。这些数据表明i）·Cl通过ROS爆发和DNA损伤驱动有效的光动力细胞毒性，和ii）Hcy@AgCl-PEG的余辉提供治疗功效的预测性、非侵入性读出-将该平台定位为图像引导的·Cl介导的PDT的有效工具。
用于体内成像和光动力治疗的氯自由基驱动的余辉纳米颗粒
为了测试·Cl驱动的余辉是否报告肿瘤氧化应激，小鼠接受87.2、174、262或349 μM的Hcy@AgCl-PEG（每个肿瘤25 μL）的瘤内注射。在固定的紫外光剂量后，在生物发光模式（无外部激发）下采集余辉图像3分钟。余辉强度随纳米颗粒浓度单调增加。肿瘤切片的离体ROS和苏木精-伊红（H&E）染色证实，较高的Hcy@AgCl-PEG剂量诱导了升高的氧化应激和相应的组织学损伤，反映了余辉趋势。保持剂量恒定（262 μM），我们改变照射时间（0、30和60 s）。更长的光照产生逐渐增强的余辉信号，ROS/H&E测定证实了肿瘤氧化损伤的相关增加。这些数据确立了Cl驱动的余辉作为肿瘤内氧化应激的非侵入性读数和治疗效果的预测因子。皮下注射PBS、Hcy NPs或Hcy@AgCl-PEG后照射4 T1荷瘤小鼠，只有Hcy@AgCl-PEG组产生强烈的余辉; PBS和HCy NP组未显示信号。荧光成像显示各组间的最小强度变化，并且信号与背景比表明余辉提供比荧光高5-10倍的对比度。我们评估静脉内给药。静脉注射Hcy@AgCl-PEG（200 μL，873 μM）;在3小时内清晰的余辉定位于肿瘤。对于全身PDT，将4 T1荷瘤小鼠分为三组：。注射后3小时，第III组小鼠接受10分钟的光照射;在第7天给予第二次治疗。仅照射的Hcy@AgClPEG组群显示出显著的肿瘤抑制而不影响体重，并且没有观察到体重的显著变化。
总结
我们建立了一个氯自由基驱动的余辉机制，其中·Cl而不是ROS作为活性物种来储存和释放能量。这种范式转变产生了完全不依赖于O2浓度的余辉发射，从而克服了传统的氧依赖系统的基本限制，并使在缺氧组织中的高对比度成像。我们通过将AgCl沉淀到负载半菁的纳米颗粒上来制备Hcy@AgCl-PEG。在光激发下，AgCl纳米颗粒产生·Cl，其与染料核心反应形成亚稳态中间体;它们的分解驱动持续的余辉。因此，Hcy@AgCl-PEG在常氧和严重缺氧条件下都表现出相同的发光强度。此外，相同的·Cl化学赋予了有效的光动力疗法（PDT）活性，而余辉信号真实的实时定量报告肿瘤内的氧化应激。
参考文献
Chlorine Radical-Driven, Oxygen-Independent AfterglowNanoplatform for Tumor Microenvironment—Adaptive Imaging andTherapy，Peng Liang, Baoli Yin, Zhe Dong, Zhe Li, Xinlin Liu, Yong Tan, Hui Cao, Jinxue Xiang,Hanlin Wei, Dingyou Lu, Xiao-Bing Zhang,* and Guosheng Song*，Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202511731，doi.org/10.1002/anie.202511731
