内容提要
余辉材料为成像提供了巨大的优势，包括激发后持续信号的超长发光寿命，由于最小的组织自身荧光干扰，高信噪比，以及近红外(NIR)余辉实现深层组织穿透的能力。AIEgens以其在光动力治疗(PDT)过程中产生的强大单线态氧(¹O2)而闻名，进一步增强了该方法。本文首次报道了如何将AIEgens与化学发光剂结合构建近红外余辉材料，实现化学发光共振能量转移(CRET)介导的AIEgens对靶向PDT的激活。DCL/TBQ纳米颗粒(NPs)证明了这种有前途的治疗设计。这些NPs对肿瘤相关生物标志物ONOO−具有高选择性和敏感性，检测限低(46.1 nm)。此外，DCL/TBQ NPs具有令人印象深刻的深层组织穿透(2厘米)，肿瘤余辉成像的信噪比显著提高120倍。最重要的是，证明了显著的肿瘤生长抑制能力。这种方法对下一代治疗药物的开发具有巨大的潜力，能够同时诊断和治疗肿瘤，提高准确性和疗效。
结果与讨论
化合物的设计与光物理性质
我们构建了一系列具有AIE性质的施主-受体(D-A)型荧光分子。选择苯并噻唑或噻吩作为 π-conjugated部分。同时，选择具有强吸电子特性的吡啶甲基盐或喹啉甲基盐作为电子受体。将这些部分合理组合，构建出具有较强ICT效应和优异AIE性能的荧光分子。在这项工作中，这些荧光分子被选为CRET过程中的能量受体，并因其优异的光物理性质而成为¹O2供体。在Schaap的1,2-二氧乙烷中引入丙烯基团等电子受体可以有效地提高水溶液的化学发光量子产率(ΦCL)，这意味着它可以在CRET过程中提供更多的能量。为了进一步增加在CRET过程中提供的能量，自切割连接臂2,6-双(羟甲基)-对甲酚与两个分子丙烯基修饰的Schaap 's 1,2-二氧乙烷和ONOO−(肿瘤中高表达的生物标志物)识别位点苯硼酸pinacolboronate结合。新设计的化学发光探针前体在被激活时可以产生更多的化学发光。该策略不仅提高了探针的灵敏度，更重要的是增加了CRET过程中的供体能量，从而增强了最终的近红外余辉信号。通过合理调节能量供体和受体，我们构建了一种新型的ONOO -活化近红外余辉材料，该材料可用于高信噪比肿瘤成像和光动力治疗(PDT)。TTP的紫外吸收是在400 - 550纳米的范围,以及其最大吸收是位于460 nm, TTQ的紫外吸收是在420 - 600纳米的范围和它的最大吸收在520 nm,紫外线吸收真沸点在400 - 600纳米的范围,其最大吸收520海里,TBQ的紫外吸收是在400 - 600纳米的范围和它的最大吸收是位于500 nm。根据上述紫外吸收值，我们可以发现上述荧光分子的紫外吸收光谱，特别是TBP、TTQ和TBQ的紫外吸收光谱与DCL的化学发光光谱存在重叠，这意味着它们能够经历显著的CRET过程。接下来，我们进一步表征了它们的AIE性质。如图所示，随着不良溶剂比例的增加，上述化合物均表现出明显的AIE现象，其中TTP在AIE状态下的发射波长为560 nm, TTQ的AIE发射波长为650 nm, TBP和TBQ的发射波长均为670 nm。在此过程中，AIE荧光发射峰明显蓝移，这是由于分子的构象被限制在聚集的分子中，导致了重组能的降低。然而，幸运的是，除了TTP外，所有化合物的AIE发射波长都达到了近红外区。以9,10-蒽基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)作为1O2的指示剂，进一步测定上述化合物的1O2生成能力。在相同的辐照强度下，TTQ、TBQ和TTP能够诱导ABDA吸光度的衰减速度比商用光敏剂RB更快。通过对比相关文献可以发现，上述AIEgens的1O2生成效率非常突出。实验结果证明了通过调节分子的共轭结构来提高1O2生成效率的可行性。此外，与暗基团相比，上述化合物在白光照射下均表现出典型的1O2电子自旋共振(ESR)信号。进一步验证了上述AIE分子诱导的活性氧为1O2。
ONOO−活化余辉发光纳米探针的制备及其机理
考虑到TBQ优异的光谱和1O2产率，同时考虑到DCL和TBQ之间的光谱匹配，以1,2-二硬脂酰sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇)−2000](DSPE-PEG2000)为聚合物基体，采用纳米沉淀法制备了TBQ和化合物DCL (Schapp 's二氧乙烷的烯醇醚前体)共包的纳米颗粒。首先，通过动态光散射表征了颗粒的大小。DCL/TBQ NPs的粒径约为100 nm。然后进一步通过透射电子显微镜证明材料制备成功。此外，我们发现DCL/TBQ NPs表现出良好的稳定性，即使放置7天，显示的变化可以忽略不计。此外，DCL/TBQ NPs在- 20°C下至少可以保存48小时的余辉发光。
基于NPs优异的稳定性，对其进行了响应光谱表征。我们探索了可能影响DCL/TBQ NPs对ONOO−反应的各种因素，以期获得其最佳反应条件。首先，由于DCL/TBQ NPs的余辉信号的产生需要TBQ产生1O2，因此预辐照时间对DCL/TBQ NPs的余辉信号强度影响较大。因此，我们研究了预照射时间(白光功率密度为60 mW cm−2)对DCL/TBQ NPs余辉信号强度的影响。基于TBQ优异的1O2生成能力，DCL/TBQ NPs在辐照5min后表现出较强的余辉信号，5min后变化较小，10min后达到饱和。由于需要TBQ在光照条件下活化DCL，因此有必要对DCL的光稳定性进行研究。DCL (10 μmol L−1)在不同白光(60 mW cm−2)照射时间条件下的吸收光谱变化不大，说明DCL具有良好的光稳定性。然后，将优化后的封装DCL/TBQ NPs(比例为1:8)进行沉淀，获得最大的余辉强度，其CRET比为2.24。因此，在随后的所有实验中，DCL/TBQ NPs(比例为1:8)首先预照射10分钟。我们进一步研究了pH值对DCL/TBQ NPs预辐照后余辉强度的影响。将预辐照的DCL/TBQ NPs(以复方DCL为基础，50 μ mL−1)分别加入50 μL ONOO−，加入pH为3.3 ~ 7.4的PBS中。如图所示，在酸性条件下(pH < 5.8)， DCL/TBQ NPs(以化合物DCL为基础的50 μg mL−1)不能产生明显的余辉信号。当pH值达到5.8时，余辉信号开始出现，直至pH值达到7.4时，余辉信号强度大大增强。这主要是由于在酸性条件下抑制了DCL的化学发光过程。也就是说，随着pH的增加，特别是达到碱度后，化学引发电子交换发光(CIEEL)过程可以促进化学发光，进一步加快化学发光过程。这些结果表明，DCL/TBQ NPs可用于生理环境下ONOO−的检测和成像。
由于DCL/TBQ NPs是可活化的，因此研究DCL/TBQ NPs的选择性是很重要的。只有当DCL/TBQ NPs具有高特异性时，才能在生物成像中表现出高特异性和高信噪比。接下来，我们研究了DCL/TBQ NPs对不同ROS (ONOO−、O2−、·OH、ClO−和H2O2)的识别能力。白光预照射后，分别在pH 7.4的DCL/TBQ NPs PBS溶液(以复方DCL为基准50 μg mL−1)中加入不同的ROS，在加入ROS后1 min用IVIS系统采集余辉信号。DCL/TBQ NPs(基于化合物DCL的50 μmol L−1)对其他ROS (200 μmol L−1)没有反应，说明DCL/TBQ NPs对ONOO−具有较高的特异性识别能力。值得注意的是，苯硼酸品纳醇酯也可以作为H2O2的识别位点。但在这里，当pH < 10时，H2O2的影响可以忽略不计，因为在pH > 10之前，过氧化氢攻击硼酸匹纳科尔亲和力的能力会明显增强。在这种情况下，H2O2对DCL/TBQ NPs的干扰可以被排除，因为我们的监测系统的环境接近中性。除了ROS的选择性外，我们还研究了DCL/TBQ NPs对其他物质的选择性。DCL/TBQ NPs同样表现出良好的选择性。在37°C的PBS (pH 7.4)中监测DCL/TBQ NPs对余辉强度的响应动力学研究。在白光(60 mW cm−2,10 min)下预照射后，加入ONOO−(41.1 μmol L−1,50 μL ONOO−原液)。NPs的余辉强度急剧增加，在onoo−加入后8 min达到峰值。DCL/TBQ NPs的余辉信号强度迅速下降。但即使在两小时后，仍然可以记录到余辉信号。这表明DCL/TBQ NPs可以用于ONOO−快速检测，并具有长期的余辉成像能力。在获得最佳响应条件后，我们进一步检测了DCL/TBQ NPs检测ONOO−的定量能力。DCL/TBQ NPs在0 ~ 50 μm范围内对ONOO−具有良好的线性响应，线性方程为Y = 650 × X + 240。根据检出限公式LOD = 3/k，计算出检出限为46.1 nm。这表明DCL/TBQ NPs对ONOO−具有较高的敏感性。为了证明CRET工艺对DCL/TBQ NPs的余辉能力的重要性，我们进一步制备了TBQ NPs和DCL NPs。从图可以看出，在白光预照射后，TBQ NPs不能产生明显的化学发光，而DCL NPs则产生微弱的化学发光。从图可以看出，未加入TBQ的NPs的化学发光信号远低于加入TBQ的NPs。结果表明，CRET过程是DCL/TBQ NPs的余辉信号来源。此外，它们的荧光信号表明DCL/TBQ NPs和TBQ NPs仍然可以进行荧光成像。综上所述，上述结果表明，DCL/TBQ NPs具有高速度、特异性和敏感性的体外ONOO -识别能力。
纳米颗粒的细胞评价
DCL/TBQ NPs有前景的体外研究鼓励我们继续对其进行体内成像研究。我们首先进行了DCL/TBQ NPs的生物相容性研究。根据MTT试验的结果，细胞在高达10 μg mL−1的浓度下仍然具有高活性。结果表明，DCL/TBQ NPs对活细胞的毒性可忽略不计。接下来，我们首先进行了DCL/TBQ NPs的细胞摄取实验。如图所示，用DCL/TBQ nps处理细胞后，可以看到TBQ发出的明显红色荧光信号。DCL/TBQ NPs加入约15 min后可见清晰的红色荧光信号，45 min后荧光信号停止变化，平均荧光强度(mfi)为14.2。以上结果表明，DCL/TBQ NPs具有快速进入细胞的能力。然后，用2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(H2DCFDA)研究细胞内单氧生成。在白光照射10 min后，倒置荧光显微镜捕捉到2 '，7 ' -二氯荧光素(DCF)的明显绿色荧光信号。光照组DCL/TBQ NPs和光照组DCL/TBQ NPs的DCF mfi分别比未光照组高6.82倍和3.48倍，表明它们具有强大的细胞内1O2生成能力。由于它具有强大的细胞内氧生成能力，我们做了一个笔记，继续检查光动力治疗效果。然后通过活细胞染色实验考察DCL/TBQ NPs的光疗效果。用Hochest 33 342(蓝色)和YO-PRO-1(绿色)分别表示活细胞和非活细胞。在无光条件下基本没有绿色荧光信号，而在有光条件下(10 min)出现明显的绿色荧光信号，4T1细胞的杀伤率为83%。以上实验表明，DCL/TBQ NPs对4T1细胞具有较高的杀伤能力。
4T1荷瘤小鼠化学发光和荧光的实时成像
由于DCL/TBQ NPs在体外的优异表现，我们进一步研究了其在组织中的onoo成像能力。对于生物成像，光学探针的组织穿透能力是很重要的。因此，我们首先检测了DCL/TBQ NPs在组织中的渗透深度。首先，用白光(60 mW cm−2,10 min)预照射DCL/TBQ NPs(基于化合物DCL的50 μg mL−1)。然后加入ONOO−(50 μL ONOO−原液)激活余辉信号，用IVIS成像系统记录余辉信号强度。随着鸡组织厚度的增加，化学发光和荧光信号均明显减弱，我们发现，当鸡组织厚度为0.5 cm时，可以同时观察到余辉和荧光信号。当鸡组织厚度为1 cm时，其余辉信号的信噪比仍为6.92，而当鸡组织厚度为2 cm时，其余辉信号的信噪比仅为2.82。结果表明，对于相同的光学材料，余辉信号比荧光信号强得多，因此余辉信号在生物成像中是更好的成像选择。研究还表明，DCL/TBQ NPs可以有效地用于体内ONOO−成像。由于DCL/TBQ NPs的余辉信号穿透深度显著，我们继续探索其体内onoo成像能力。首先采用全身化学发光和荧光成像的方法研究了DCL/TBQ NPs对小鼠皮下4T1肿瘤的成像实验。将DCL/TBQ NPs(以化合物DCL为基础，100 μg mL−1)先用白光(60 mW cm−2,10 min)预照射，然后将NPs注射到瘤小鼠或正常小鼠体内，用IVIS成像系统成像。DCL/TBQ NPs的化学发光信号随着孵育时间的延长逐渐增强，在≈6 min时达到峰值。另一方面，DCL/TBQ NPs的荧光信号基本不变。这表明DCL/TBQ NPs能够在4T1荷瘤小鼠模型中有效地实时成像高表达的ONOO−。
体内余辉成像引导的DCL/TBQ NPs的光动力治疗效果
由于TBQ在DCL/TBQ NPs中具有出色的1O2生成能力，我们接下来基于DCL/TBQ NPs研究了其对肿瘤的PDT能力。在体内，通过15天的随访，综合评估DCL/TBQ NPs在4T1荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤功效。与对照组相比，“DCL/TBQ NPs + Light”组肿瘤生长明显受到抑制。此外，在没有白光照射的情况下，DCL/TBQ NPs仍能轻微抑制肿瘤生长，说明DCL/TBQ NPs具有一定的暗毒性。H&E染色结果显示，未照射时DCL/TBQ NPs组的肿瘤杀伤能力较弱，而“DCL/TBQ NPs + Light”组的肿瘤杀伤能力较强。以上实验表明，DCL/TBQ NPs产生的1O2具有良好的抑瘤作用。主要是，所有组的小鼠体重都有适度的增加。根据小鼠体重变化趋势可以发现，DCL/TBQ NPs对本研究给药的药物和治疗对小鼠的副作用相对较低。此外，我们还收集了治疗小鼠的主要器官组织活检进行组织病理学检查。经H&E染色，各组均未见明显病理改变。最后，当DCL/TBQ NPs浓度达到500 μg mL−1时，未出现明显的溶血现象，说明NPs与血液具有较高的生物相容性。
总结
我们报道了DCL/TBQ纳米颗粒的开发，这是一种具有生物医学治疗潜力的新型多功能余辉材料。我们的设计策略包括构建可被ONOO−激活的DCL。在DCL中引入连接臂有两个关键目的，提高灵敏度和供体能量，以及改善近红外余辉成像。此外，纳米颗粒中TBQ产生1O2的特殊能力使它们能够显著抑制肿瘤生长，证明DCL/TBQ NPs具有强大的光动力治疗效果。总的来说，这项工作为多功能余辉材料在各种生物医学研究中的应用提供了重要的进展。
参考文献
Chemiluminescent Afterglow Material for Enhanced Tumor Diagnosis and Photodynamic Therapy Shuai Huang, Shuaige Bai, Ting Luo, Fan Zheng, Duoyang Fan, Yiyang Zhou, Jie Dong, Fei Chen, and Wenbin Zeng*, Adv. Funct. Mater. 2024, 2409292, https://doi.org/10.1002/adfm.202409292
