内容提要
我们报道了用于癌症治疗诊断的 X 射线照射后具有近红外余辉和 1O2 产生的有机发光体 (IDPA)。 IDPA 的体内放射余辉比报道的无机纳米磷光体亮 >25.0 倍，而 1O2 的放射动力学产生比市售放射敏化剂高 >5.7 倍。IDPA 的模块化结构允许开发智能分子探针，该探针仅在存在癌症生物标志物的情况下触发其无线电余辉动态功能。 因此，该探针能够以极好的对比度（肿瘤与背景比为234）对微小肿瘤（0.64 mm）进行超灵敏检测，并在低剂量下以分子精度对脑肿瘤进行肿瘤特异性放射治疗。
有机发光体的合成及余辉机理
首先，合成了受体，包括二氰亚甲基-4H-喹啉（DBQ）、二氰亚甲基4H-苯并吡喃（DBP）、二氰亚甲基-4H-苯并噻喃（DBTP）和二氰亚甲基-4H-苯并硒吡喃（DBSeP）。这些受体分别与带有或不带有重原子（碘）的苯氧基-亚金刚烷基连接，形成DBQ-苯氧基-亚金刚烷基（DPAN）、DBP-苯氧基-亚金刚烷基（DPAO）、DBTP-苯氧基-亚金刚烷基（DPAsu） 、 DBSeP-苯氧基-亚金刚基 (DPASe ) 和相应的含碘对应物，即 IDPAX（X = N、O、Su 和 Se）。 所有化合物均通过核磁共振和液相色谱-质谱法确认。在水溶液中研究了 DPA 和 IDPA 的光学性质。X射线照射（250 μGy s−1）20秒后，DPA和IDPA显示出射电余辉，发射最大值范围为624至792 nm，光谱轮廓接近其荧光。 碘的存在不会改变发射最大值； 然而，它增加了射电余辉强度（IDPAO 与 DPAO 相比约为 1.62 倍，IDPASu 与 DPASu 相比约为 6.46 倍，IDPASe 与 DPASe 相比约为 6.65 倍）。 它们的半衰期为 9.2 至 196.8 分钟。 其中，IDPASu在~773 nm处具有最高的亮度和相对较长的发射最大值，具有长达~25小时的持久射电余辉。 同时，IDPASu的无线电余辉可以在十个周期后以最小的强度下降被重复诱导，因为一个周期的照射仅消耗约3%的IDPASu，显示了其纵向成像的能力。
深部组织余辉性能研究
为了诱导余辉，在信号检测之前用X射线或光穿过鸡胸组织照射IDPASu。 为了消除强度差异对组织穿透的影响，对X射线和光照射进行优化，以确保强度相似而不覆盖组织。 在 1 cm 的组织深度，由于光散射和反射，很难产生光余辉，显示强度（7.20 × 104 光子 s–1 cm–2 sr–1 ）略高于背景（~6.10 × 103 光子 s–1 cm–2 sr–1 ); 相比之下，射电余辉达到~1.79×106光子s–1 cm–2 sr–1。 IDPASu 的无线电余辉甚至可以通过约 15 cm 的组织进行诱导和检测，其信号比没有 X 射线照射和组织的 IDPASu 的信号高约 4.2 倍。 通过测量不同组织深度的 1O2 生成并与光敏作用进行比较来测试 IDPASu 的深部组织放射动力学过程。 在没有组织覆盖的情况下，X 射线和光都有效诱导 IDPASu 生成 1O2 在组织深度1 cm处，IDPASu X射线照射产生的1O2浓度略有下降~30%； 相比之下，它接近光照射的背景。 此外，IDPASu 的 1O2 放射动力生成在 15 cm 的组织深度仍可诱导。 为了验证 IDPASu 对于癌症放射治疗的适用性，研究了有和没有 X 射线照射的细胞活力。 即使在 100 μM 的高浓度下，IDPASu 本身也表现出 91% 的活力。 然而，在X射线照射下（2 Gy，100 mGy s−1，20 s），由于产生细胞毒性 1O2，存活率急剧下降至1.4%。即使在15cm的组织深度（31.9%），仍然可以诱导这种放射治疗效果。 IDPASu溶液的射电余辉信号与其浓度呈线性相关，即使IDPASu浓度为100μM，辐射也不会引起任何热量产生。 通过检测皮下注射 IDPASu 的无线电余辉来研究 IDPASu 的体内成像灵敏度，显示 IDPASu 的检测限 (LOD) 低至 49 nM。 通过将 IDPASu 瘤内注射到荷瘤裸鼠中，然后分三次进行总剂量 0.3 Gy 的 X 射线照射来验证 RDT 能力。 这种 IDPASu 介导的 RDT 完全抑制了肿瘤生长，并且没有引起体重减轻。
为了实现精确的癌症诊断和治疗，IDPASu被修改为分子放射余辉动态探针（MRAP），只有在肿瘤生物标志物，即组织蛋白酶B（CatB）存在时才激活其放射余辉和放射动力学功能。 选择 CatB 是因为它在多种癌细胞中表达上调，在肿瘤生长和进展中发挥作用32。 MRAP 包含三个关键单元：肿瘤靶向部分（环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (cRGD)）、放射余辉动态治疗诊断部分和 CatB 可裂解肽部分 (Cit-Val)。 在没有CatB的情况下，MRAP的射电余辉和放射动力学1O2的产生可以忽略不计，因为苯氧基亚金刚单元中苯酚单元的氧原子的给电子能力减弱，抑制了其分子内电荷 转移。 在 CatB 存在的情况下，肽部分被裂解，释放出未锁存的 MRAP（经 HPLC 证实），导致在 ~770 nm 处激活放射性余辉，信号增强 312 倍。 MRAP 对 CatB 的选择性优于其他酶，例如碱性磷酸酶 (ALP)、氨肽酶 N (APN)、弗林蛋白酶、γ-谷氨酰转移酶 (GGT)、硝基还原酶 (NTR)、β-半乳糖苷酶 (β-gal) 和尿激酶纤溶酶原 激活剂（uPA）（图3c）。 此外，MRAP 的无线电余辉强度与 CatB 的浓度具有良好的线性关系，LOD 较低，约为 1.22 ng ml-1。MRAP 的生物标志物可激活放射动力学效应通过 ESR 进行了验证，显示 MRAP 与 CatB 一起孵育，然后进行 X 射线照射，1O2 的 ESR 信号增加了 7.8 倍。 在确认其良好的细胞相容性后，在U87胶质母细胞瘤细胞（CatB阳性）和3T3成纤维细胞（CatB阴性）中测试了MRAP的生物标志物特异性。与 MRAP 和辐射一起孵育后，在 U87 细胞中观察到强烈的放射余辉，这与 3T3 细胞和用 CA-074（一种 CatB 抑制剂）预处理的 U87 细胞的信号形成鲜明对比，显示信号为 低作为背景。 在每孔细胞数为4×104时，U87细胞的射电余辉强度是3T3细胞的78.5倍。X射线照射后，CatB过表达细胞的细胞活力随着MRAP浓度的增加而降低，而低CatB表达的细胞即使在高浓度的MRAP（100μM）下也没有观察到明显的毒性。 例如，U87细胞的细胞活力随着MRAP浓度的增加而降低，在10 μM时达到38.2%； 相反，无论 MRAP 浓度如何，经 MRAP 处理的 3T3 细胞的细胞活力仍接近 100%。 因此，MRAP 仅在 U87 细胞中被激活，验证了其放射余辉和放射动力学毒性是 CatB 所特有的。 在覆盖有 15 厘米厚组织的溶液和细胞中也观察到了 MRAP 的分子无线电余辉动态选择性，显示了其精确深部组织癌症治疗诊断的潜力。
体内癌症放射余辉动态治疗诊断学
使用表达荧光素酶的 U87 癌细胞系 (U87-Luc) 在颅内胶质母细胞瘤小鼠模型中验证了 MRAP 的癌症放射余辉动态治疗诊断能力。U87-Luc肿瘤植入14天后，通过向携带U87肿瘤的小鼠静脉注射MRAP或不含cRGD的MRAP进行纵向RAI。 MRAP 和无 cRGD MRAP 的无线电余辉信号逐渐增加，并在注射后 24 小时达到最大值，显示肿瘤与背景比（TBR）分别约为 173 和 38 。 相比之下，信号仍然与无肿瘤健康小鼠的背景一样低。 MRAP 相对于无 cRGD 的 MRAP 更高的 TBR 归因于 cRGD 对肿瘤中过度表达的 αvβ3 整合素的靶向能力，这也通过 MRAP 相对于 cRGD 更高的注射剂量百分比 (ID%) (10.4%) 得到了验证 注射后 24 小时无 MRAP (3.1%)。 然后，研究了探针和片段的药代动力学。MRAP 的血浆消除半衰期 (t1/2) 约为 4.2 小时，略长于不含 cRGD 的 MRAP (t1/2 = 约 3.1 小时)。 确认静脉注射 MRAP 后 24 小时出现最高信号后，将 MRAP 介导的 RDI 安排在第 0、3、6 和 9 天，分次剂量为 0.8 Gy。通过腹腔注射 d-荧光素的小鼠 U87-Luc 细胞的生物发光信号连续监测肿瘤生长。 经过四次RDT后，肿瘤生长完全被抑制，而其他组则没有出现明显的肿瘤生长消退或抑制。 因此，MRAP介导的RDT组的存活时间从37天（磷酸盐缓冲盐水（PBS））增加到76天，显示直到67天的存活率为100%。第21天通过苏木精和伊红（H&E）染色验证，MRAP介导的RDT后肿瘤组织仅约1.61 mm2，比PBS + X射线组（约9.24 mm2）小约5.74倍。 此外，MRAP介导的RDT肿瘤组织中癌细胞的密度远低于其他组，显示出明显的细胞死亡。 单态氧传感器绿（SOSG）免疫荧光染色证实了X射线照射下MRAP在肿瘤中有效地原位生成1O2。 同样，caspase-1染色和TUNEL检测显示MRAP介导的RDT组发出强烈信号，表明癌细胞发生焦亡和凋亡。
总结
利用 X 射线诱导深层组织中光学制剂的光物理过程导致了 RAI 和 RDT 的出现。 这些混合模式不仅解决了光学成像和癌症光疗的组织穿透问题，而且还最大限度地减少了对正常组织的辐射损伤。 然而，只有无机纳米磷光体可用于这两种应用，并且它们的无线电余辉动态功能始终处于开启状态，限制了它们在癌症检测和治疗中的特异性和功效。 为了使有机分子产生放射余辉，我们提出了一种基于有机发光体（DPA和IDPA）的放射动力学方法，该方法能够收集X射线能量用于原位环加成反应以形成自发光化学缺陷。 这在机制上不同于无机纳米磷光体，其中主体材料（例如氟化物和铝硅酸盐）吸收X射线，晶格缺陷延迟激子，稀土/过渡金属离子掺杂剂（例如Nd3+和Eu3+）发光。 由于存在重原子（碘），IDPA 比无碘对应物 (DPA) 具有更高的放射动力学 1O2 生成和更强的射电余辉发射。即使在 15 cm 的组织深度，IDPA 的射电余辉动态过程也可以诱导，这在使用光时是不可能的。 此外，IDPA 的余辉半衰期（18.4 分钟）与无机纳米磷光体相当，但基于相同质量的体内强度高出 25.4 倍（1.27 × 106 与 5.00 × 104 光子 s–1 cm–2 sr–1 μg–1）； 如此高的亮度导致在比无机纳米磷光体深 2.5 倍的组织深度（5.0 厘米与 2.0 厘米）中感应和检测无线电余辉信号。 为了实现高癌症治疗诊断特异性，候选放射性发光体（IDPAsu）被开发成智能探针（MRAP），它仅在癌症生物标志物（CatB）存在时才开启其放射性余辉动态功能。 这种生物标志物激活的 MRAP 放射余辉带来了超高的灵敏度，其 TBR 值甚至比用于皮下肿瘤成像的第二种近红外放射动力纳米磷光体 (NaYF4 :Er@NaYF4) 高出约5.7倍相比。 因此，基于 MRAP 的 RAI 检测到超小肿瘤（6 mm3，直径 2.3 mm），比临床成像方法（>7.0 mm）和循环肿瘤 DNA 传感器（>10.0 mm）更敏感。
参考文献
Molecular radio afterglow probes for cancer radiodynamic theranostics， Jingsheng Huang Ruiping Zhang , Lichao Su, Cheng Xu， Xiaoguang Ge, Jibin Song ,& Kanyi Pu ，Nat. Mater | Volume 22 | November 2023 | 1421–1429， https://doi.org/10.1038/s41563-023-01659-1
