我们报告了一种级联x射线能量转换方法，用于开发用于癌症治疗的有机放射余辉纳米探针（RANPs）。ranp包括一个无线电波吸收剂，它将x射线能量向下转换以发射辐射发光，辐射发光被转移到辐射敏化剂中产生单线态氧（1O2）。O2随后与放射性余辉底物发生反应，生成一种活性中间体，该中间体同时分解释放出放射性余辉。通过微调这种级联、粒子内辐射发光能量转移和1O2转移过程，RANPs具有可调谐的波长和较长的半衰期，并在高达15厘米的组织深度产生无线电余辉和1O2。我们开发了一种生物标志物可激活的纳米探针（tRANP），它能产生肿瘤特异性的放射余光信号，从而实现超灵敏的检测，并在比无机材料低20倍的x射线剂量下手术切除小肿瘤。tRANP的有效放射动力学1O2生成允许在低于临床放疗的x射线剂量和比大多数现有无机药物低一到两个数量级的药物剂量下完全根除肿瘤，从而延长生存率并最小化与辐射相关的不良反应。
RANPs的成分筛选
为了优化射电余辉，筛选了RANPs的组成。辐射吸收剂是具有高x射线转换效率（光产率，bbb104光子MeV−1）的有机试剂，包括蒽、聚苯乙烯、9,10-二苯基蒽和2,4,5,6-四基（3,6-二叔丁基咔唑-9-基）-1,3-二氰苯（CzTPN）。辐射增敏剂是红卟啉、维托酚芬和2,3-萘菁硅二（三己基硅氧烷）（NIR775），因为它们对近红外荧光具有明亮的可见性和高的1O2量子产率。放射余辉物质为二氰亚甲基- 4h -苯并噻吩吡喃-苯氧基-亚丁二烯（dpaas）和(2-（3-（E)-4-羟基-2-（(1R,5R,7S)-4′-甲氧基螺[亚丁二烯-2,3′-[1,2]二氧基]-4′-基）苯基）-5,5-二甲基环己基-二氧基）丙二腈（DTDP），它们可以形成二氧基中间体，发出明亮的化学发光。通过纳米沉淀法将辐射吸收剂、辐射增敏剂和辐射余光基态以两亲性聚合物为基质共负载到纳米颗粒中，包括聚乙二醇-块聚丙二醇-块聚乙二醇（PEG-PPG-PEG, Pluronic F127）、聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)-PEG或2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-PEG （DSPE-PEG）。加载CzTPN的纳米颗粒比加载其他放射性吸收剂的纳米颗粒发射出更亮的辐射余光，这一差异主要归因于CzTPN的光产率更高（4.5 × 104光子MeV−1）。此外，载血卟啉纳米颗粒表现出比载椎体卟啉和nir775纳米颗粒更高的放射余辉信号，这与它们的1O2产率一致。此外，负载DTDP的纳米粒子比负载DPAs的纳米粒子发射出更亮的放射性余辉，可能是因为DTDP的化学发光量子产率比DPAs高约20倍。然而，DTDP的发射波长较短（峰值在552 nm），在生物组织中可能会减弱，从而限制了体内深部组织成像。因此，尽管其产生o2的能力适中，但与DTDP发射和荧光峰值在788 nm处有吸收光谱重叠的NIR775被选为辐射增敏剂，以“传递”DTDP的能量。
级联x射线能量转换
为了研究射电余晖的机理，首先在单独装载CzTPN的F127纳米颗粒中测试了辐射致发光（实时x射线照射下的光发射）。在x射线照射下，CzTPN纳米颗粒发出明亮的放射发光，最大发射点在563 nm，与CzTPN在420 nm最大吸收处激发时的荧光光谱相似。这表明CzTPN的放射发光涉及“S1→S0”弛化。此外，随着x射线管电流（0 ~ 0.5 mA）的增加，纳米颗粒中CzTPN的含量增加，辐射发光强度也随之增加。当CzTPN:F127质量比为1:50时，测量到的信号最高；观测到的降水超过了这个比例。在此质量比下，载蒽或聚苯乙烯的F127的辐射发光信号分别比载CzTPN纳米颗粒低4倍和10倍。与其他纳米粒子相比，CzTPN纳米粒子的辐射发光亮度相对较高，这与CzTPN的高光产率相吻合，这主要归因于其较低的S1-T1能隙（ΔEST < 0.1 eV），有利于系统间的反向交叉和丰富的电子给体-受体结构，促进了分子内电子转移。为了测试从辐射吸收剂到辐射敏化剂的x射线能量传递和辐射动力学效应，将NIR775单独或与CzTPN共负载到F127纳米颗粒中。在750 nm以上，NIR775纳米颗粒的辐射发光可以忽略不计；相比之下，CzTPN/NIR775纳米颗粒显示的信号更亮，是CzTPN纳米颗粒的30倍。此外，CzTPN/ NIR775纳米粒子的辐射发光光谱与420 nm激发的荧光光谱相似，在563 nm处显示CzTPN和788 nm处对应的两个特征峰。随着NIR775掺杂量的增加，近红外辐射发光增加，而CzTPN的可见辐射发光减少。在质量比为1:10 （NIR775:CzTPN摩尔比为1:11）时显示出最高的强度，RET效率为68.9%。超过该比值的近红外辐射发光急剧下降是由NIR775的自猝灭引起的。除了放射发光外，在同等质量浓度下，NIR775/CzTPN纳米颗粒的1O2产率分别比单NIR775或单CzTPN纳米颗粒高100倍和156倍。当NIR775:CzTPN掺杂比为1:10 （w/w）时，O2生成率最高，符合辐射发光的最佳配比。此外，随着CzTPN/NIR775纳米颗粒x射线剂量和浓度的增加，1O2的生成也增加。然而，没有检测到超氧阴离子或羟基自由基（Supplementary Fig. 10），表明1O2是由典型的II型光敏剂NIR775产生的。
放射余辉成像深度和放射动力学细胞毒性的体外研究
为了证明深层组织的放射性余辉，RANP通过不同厚度的鸡胸组织用x射线或激光照射；然后取出组织并测量信号。注意，调整x射线和激光照射条件，使其在没有鸡胸覆盖的情况下提供相同的余辉强度。光余辉和射电余辉强度随组织厚度的增加而减小，但射电余辉在所有深度都比光余辉亮，在2.5 cm的组织深度显示出高50倍的信号。射电余辉在15 cm处仍有诱导作用（SBR = 3.7），而光余辉在5 cm处几乎没有诱导作用（SBR = 2.3）。此外，当通过组织进行预辐照和信号采集时，在5 cm处（SBR = 5.9）可以检测到辐射余辉，与光余辉在1.5 cm处（SBR = 5.0）形成鲜明对比。为了深入了解深层组织中相对于光余辉更亮的无线电余辉，研究了x射线或激光照射下RANP产生的1O2。在没有组织覆盖的情况下，控制x射线和激光照射条件，使RANP产生的1O2相同。x射线和激光照射诱导O2生成的最大深度分别为15 cm和5 cm。这些数据证实，与光余辉相比，放射余辉的深层组织成像优势是由于相对于光动力过程，放射动力过程在深层组织中的1O2产率更高。研究了RANP对4T1和MCF-7癌细胞的放射余辉成像和放射动力学效应。与RANP孵育12小时后，观察到细胞的放射余辉信号，验证了RANP的细胞摄取。相比之下，用单组分纳米颗粒（即CzTPN纳米颗粒、NIR775纳米颗粒和DTDP纳米颗粒）处理的细胞的辐射余辉信号可以忽略不计。通过细胞计数试剂盒-8 （CCK-8）测定不同孵育浓度（5-80 μg ml−1）下RANP的放射动力学细胞毒性。在没有x射线照射的情况下，即使在最高RANP浓度下，细胞的死亡也可以忽略不计；相比之下，细胞活力随着x射线剂量从0.01 Gy到2 Gy的增加而下降，0.5 Gy时仅显示10%。即使通过15厘米厚的组织，也可以达到70%的细胞杀伤，验证了ranp介导的深部组织放射动力学治疗的可行性。处理后的细胞进一步用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的膜联蛋白和碘化丙啶（PI）染色，然后进行流式细胞术分析。ranp处理和x射线照射的细胞显示出最低的活细胞数量（约20%），与细胞毒性试验一致。注意，早期凋亡细胞（annexin- fithigh /PIlow）占细胞的约52%，比其他组高约5倍。这表明在ranp介导的放射动力学治疗中，细胞凋亡是细胞死亡的主要原因，有可能增强免疫原性，从而有利于肿瘤免疫治疗。
体内放射余辉肿瘤治疗
为了实现精确的放射余辉成像，肿瘤特异性RANP （tRANP）被开发出来，仅在H2O2存在下激活其放射余辉，H2O2在肿瘤中被上调。DTDP被苯硼酸酯（一种被H2O2特异性氧化的片段）笼化（参考文献27），使cDTDP分子内电荷转移减少，从而抑制了余辉的发射（补充方案1）。在H2O2存在下，cDTDP在tRANP中的笼化基团被切割，在17分钟时通过新的高效液相色谱（HPLC）洗脱峰验证，导致放射性余辉增加40倍。经过h2o2处理的tRANP的射电余辉光谱曲线与其荧光相似。与超氧阴离子（O2·−）、一氧化氮（NO）和羟基自由基（HO·）等其他活性物质相比，tRANP对H2O2具有极好的选择性（Supplementary Fig. 29）。在H2O2和x射线照射处理的4T1细胞中观察到生物标志物可激活的放射余辉，其信号分别比x射线或H2O2单独处理的细胞高11倍和8倍。为了在体内研究肿瘤特异性放射余辉，将tRANP皮下注射到小鼠的左侧，并在右侧的4T1肿瘤中瘤内注射。在注射后10分钟，在射电余辉采集之前，用x射线照射注射部位。肿瘤上的放射余辉信号是皮下部位的39倍，其SBR高达169，而荧光信号为14。
为了研究体内放射动力学治疗效果，对4t1肿瘤小鼠皮下静脉注射tRANP，并对肿瘤进行三个x射线部分（每个部分1 Gy）照射，该方案在中试试验中进行了优化。用x射线照射小鼠或单独使用tRANP进行比较。tRANP加x线照射完全抑制肿瘤生长，治疗后3周肿瘤抑制率高达97.2%，无复发；相比之下，trp单独产生的肿瘤抑制作用可以忽略不计，其生长曲线与磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理组相似。x射线单独照射有轻微的抑制作用，肿瘤在第11天恢复活力。trp结合低剂量x射线有效根除肿瘤，使荷瘤小鼠的生存时间延长至治疗后1个月。需要注意的是，完全根除肿瘤也可以通过单独的x射线照射来实现，其剂量比tranp介导的放射动力学治疗高6倍，相当于用于临床放疗的x射线剂量（三个x射线部分，每个部分6 Gy）。通过在指定治疗后的小鼠肿瘤中注射1O2传感器绿（SOSG），进一步分析了tRANP有效抑制肿瘤的机制。在x射线照射（1 Gy）后，收集肿瘤并切片进行荧光成像。tRANP + x射线照射在所有组中肿瘤中引起的SOSG荧光最高，证实了肿瘤内1O2的有效生成。结果，tranp介导的放射动力学治疗导致各组中肿瘤损伤面积最大，其特征是细胞核消失和细胞形态破裂，以及凋亡生物标志物caspase-3的最高表达水平；此外，钙网蛋白（CRT）和高迁移率组盒1 （HMGB-1）的表达水平最高，提示发生了免疫原性细胞死亡。因此，经tranp介导的放射动力学治疗的小鼠肺转移结节最少。
总结
本研究报告了一种通用而有效的方法，通过x射线能量和1O2级联转移过程来利用有机放射余辉和放射动力学纳米粒子（RANPs）的组合，并揭示了控制放射治疗效果的关键参数。RANPs的模块化组成和明确的机制使其能够微调其放射余辉波长，亮度和生物标志物响应性，从而形成智能的癌症特异性放射治疗纳米探针。这些RANPs不仅具有在赋形期超灵敏检测微小病变的潜力，而且还具有以最小剂量对癌症以外的深层疾病进行精确和安全放射治疗的潜力。此外，计算机断层扫描仪和RANPs在x射线设置上的相似性使得进一步开发双峰成像探针成为可能。这一进步将允许在一次计算机断层扫描中同时获取疾病的解剖和分子信息。在这项工作中，RANP仅在肿瘤模型中进行了测试，未来可能会在更广泛的生物体中验证更多的疾病模型。总的来说，我们的工作揭示了一种解决有机放射治疗生物材料缺乏的通用方法，并为精确放射治疗提供了分子设计。
参考文献
A cascade X-ray energy converting approach toward radio-afterglow cancer theranostics，Cheng Xu ，Dan Ding ，Xue Qin,Xin Wei,Jie Yu,Youjia Zhang,Yan Zhang ,Jibin Song & Kanyi Pu， Nat. Nanotech，https://doi.org/10.1038/s41565-024-01809-9
