内容提要
分子成像通过余辉发光最小化组织自身荧光和增加信噪比。然而，余辉的产生需要光的预先照射，光通过组织中的散射和吸收而减弱。在这里，我们报告了产生超声诱导余辉的有机纳米颗粒的发展，以及它们在癌症免疫治疗中的概念验证应用。“sonoafterglow”纳米颗粒包含一种声敏剂，作为引发剂产生单线态氧，随后激活衬底，发射余辉发光，在更大的组织深度（4厘米）比以前报道的光诱导余辉更亮，更可检测。我们为免疫反应调节剂咪喹莫特制备了含有单线态氧可切割前药的sonoafterglow纳米颗粒，该纳米颗粒在炎症生物标志物过氧亚硝酸盐存在下特异性开启，过氧亚硝酸盐由肿瘤相关的M1样巨噬细胞过量产生。纳米粒子的全身递送允许超声余光引导治疗小鼠皮下乳腺癌肿瘤。
为了优化声余辉，筛选了一系列在超声应用中产生1O2的声敏剂作为声余辉引发剂，包括玫瑰孟辛酯（RB）、血卟啉（HMP）、维托普芬（VP）和硅2,3-萘菁二（三己基硅氧烷）（NCBS）。此外，它们是具有可见光至近红外发射的荧光剂。筛选了可与1O2反应产生自发光二氧乙烷中间体的聚合物或小分子，以作为声余辉底物，包括苯氧基-adamantylidene (PA)，叠氮-甲基丙烯酸-苯氧基-adamantylidene (AMPA)，聚[2-甲氧基5-（2 ' -乙基己氧基）-1,4-苯基乙烯](MEHPPV)，在两亲性稳定剂聚乙二醇-嵌段聚丙二醇-嵌段聚乙二醇-嵌段聚乙二醇（PEG-b-PPG-b-PEG）的存在下，用这些声余辉引发剂和底物的不同组合通过共纳米沉淀法制备了SNAPs。研究并比较了snap的声余辉性能，优化了其组成。在SNAP中，声余辉引发剂与衬底的最佳质量比为1:5，超声应用条件优化为2.0 W cm−2，持续30 s。NCBS/AMPA SNAP的声余辉强度最高，是其他测试SNAP的3.1 ~ 243.6倍。此外，声余辉发射的来源取决于衬底和引发剂之间的光谱重叠。当声余辉衬底的发射与引发剂的吸收重叠时，会发生能量转移，导致引发剂（如NCBS/MEHPPV SNAP）的声余辉发射。此外，声余辉发射主要由衬底主导，如RB/DPAo SNAP。SNAP的声余辉半衰期从70秒到180秒不等（例如，NCBS/DPAs SNAP的半衰期为110秒），这足以进行体外和体内成像。考虑到NCBS/DPAs SNAP在近红外区域的声余辉强度最强（峰值在780 nm），我们选择NCBS/DPAs SNAP进行后续实验。
深层组织感应明亮的声波余辉
在超声（1.0 MHz）和激光（808 nm）作用相同时间（30 s）后获取NCBS/ DPAs SNAP的声光余辉和光余辉信号进行比较。超声功率强度为2.0 W cm−2，为先前优化的功率强度，在皮肤安全范围内（1.0 ~ 3.0 W cm−2）；然而，激光应用在其最大允许曝光（0.33 W cm−2）。在此条件下，声余辉强度是光余辉强度的2.4倍，与激光照射90 s后的强度相当。为了进一步了解声波余辉比光余辉更亮的原因，研究了超声和激光照射下NCBS产生的1O2。在相同时间内（30 s），超声作用下的O2生成比激光照射下的O2生成高1.6倍，表明更高效的O2生成是产生更强的声余辉信号的因素之一。长期超声照射（5 min）后，NCBS/DPAs SNAP诱导90%的癌细胞死亡，比相同时间激光照射下高1.6倍。为了研究空化对细胞活力的影响，将无NCBS的SNAP （SNAPc）与癌细胞孵育，然后超声应用。相同浓度的SNAPc和SNAP分别导致19.8±3.9%和84.9±4.7%的4T1癌细胞死亡，说明空化对细胞活力的影响较小。此外，电子自旋共振（ESR）光谱显示，超声作用下SNAP产生的1O2比其他活性氧（包括·OH和O2·−）高约216倍。这些发现证实了肿瘤细胞的杀伤主要归因于声敏剂在SNAPs中的声动力效应。总的来说，这种应用时间依赖的超声毒性可以实现安全的声余辉成像（短期，30秒）和声动力肿瘤杀伤（长期，5分钟）。为了研究在组织中诱导和检测深度声余晖的程度，将NCBS/DPAs SNAP溶液覆盖在鸡胸组织上，然后通过组织进行超声或激光照射，然后进行信号检测。为了排除强度差异对组织穿透深度的影响，采用超声照射（2.0 W cm−2，持续30 s）和近红外激光照射（0.33 W cm−2，持续90 s）获得相同的余辉强度。
生物标志物激活的声波余辉成像
促炎微环境状态在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用，因此它可以作为癌症免疫治疗的预后标志。尽管分子成像在癌症诊断和治疗中具有重要意义，但大多数现有显像剂具有“始终打开”信号，并且在被动积累时产生非特异性信号。为了使信号与肿瘤微环境的促炎状态相关联，我们基于NCBS/DPAs SNAP开发了一种可激活的分子声余辉探针（我们将其命名为SNAP- m）。选择过氧亚硝酸盐（ONOO -）作为促炎肿瘤微环境的生物标志物，据报道其与免疫治疗的阳性预后相关。ONOO -由肿瘤相关的M1样巨噬细胞（M1巨噬细胞）通过一氧化氮（NO，诱导型一氧化氮合酶的产物）和超氧阴离子（O2·−，线粒体电子传递链的产物）之间的反应过量产生，并广泛分布于肿瘤微环境。ONOO -发挥直接的肿瘤杀伤作用，并促进其他免疫激活因子抑制肿瘤血管生成，抑制转移生态位形成，使M1巨噬细胞具有抗肿瘤表型，与促肿瘤M2巨噬细胞形成鲜明对比。与NCBS/DPAs SNAP不同，SNAP- m由一个沉默的dpa组成，其中包含ONOO响应部分（pro - dpa）。因此，在以M1为特征的促炎肿瘤微环境中，SNAP-M的sono余辉可以被高度上调的ONOO -特异性激活。同时，“永远打开”的NCBS荧光用于跟踪SNAP-M的位置。为了研究SNAP-M的检测选择性，我们用不同的活性氧和活性氮（RONS）以及金属离子孵育后检测了sonoafterglow。与ONOO -孵育后，snapm的声余辉增加了140倍，但对次氯酸盐（ClO -）、超氧阴离子（O2•-）、羟基自由基（•OH）、过氧化氢（H2O2）和一氧化氮（NO）以及金属离子(钙离子（Ca2+）和亚铁离子（Fe2+）等其他ron几乎没有变化。此外，SNAP-M的声余辉与ONOO -浓度具有良好的线性关系，检测限（LOD）低至0.3 μM。体外研究SNAP-M对M1巨噬细胞的声纳余辉开启特异性。M1巨噬细胞经M1极化因子（LPS：脂多糖和IFN-γ：干扰素-γ）30处理后从Raw 264.7细胞（M0巨噬细胞）分化而来，通过M1特征形态和上调的iNOS证实了这一点。SNAP-M与各种细胞（M1、M2、M0巨噬细胞、4T1癌细胞或NIH 3T3成纤维细胞）孵育12 h后检测sonoafterglow。NCBS的荧光强度在所有测试细胞中都是相同的，这表明SNAP-M的细胞摄取是相似的。而SNAP-M在M1巨噬细胞中的声余辉最强，其声余辉亮度是M0和M2巨噬细胞的5.0倍。此外，在ONOO -清除剂n -乙酰半胱氨酸预处理后，M1巨噬细胞的sonoafterglow显著降低至基础水平。
利用声波余辉进行癌症免疫治疗
只有在促炎肿瘤微环境中存在高水平的ONOO -时，声余辉引发剂才会被激活，产生声动力效应（产生1O2），从而导致声余辉从底物AMPA反馈；此外，产生的1O2导致Pro-R837的咪喹莫特断裂，用于原位激活免疫治疗。按照设计，由于MB处于笼状，SCAN本质上显示可以忽略的荧光、超声作用下的1O2生成和sono余辉。添加ONOO后，SCAN的荧光增加了95.1倍，1O2产生增加了4.4倍，sono余辉增加了近80倍。而其他被测ron和金属离子未见明显变化。扫描声光余辉强度与ONOO -浓度相关性良好，LOD为0.1 μM，比荧光LOD低2倍。此外，非激活SCAN在超声作用下不会导致4T1癌细胞死亡；相比之下，ONOO -激活的SCAN在超声作用5分钟后导致78.1%的4T1癌细胞死亡。这表明，在ONOO -存在的情况下，SCAN有效的声动力肿瘤杀伤作用被特异性激活。
体外研究了ONOO和超声双锁激活对SCAN的免疫治疗作用。在没有ONOO -的情况下，即使超声扫描后，在高效液相色谱（HPLC）中也很难观察到与游离咪喹莫特相关的洗脱峰（保留时间TR = 10.5 min）。只有用ONOO -预处理SCAN后，咪喹莫特峰才会在超声作用后清晰地显示出来，并随着时间的推移而增强，最终达到Pro-R837高达83.5%的高激活水平。通过使用完全激活的SCAN （ONOO -预激活和超声预照射）处理M2巨噬细胞，然后添加完整的SCAN，研究声余光与M1取向巨噬细胞极化的相关性，研究SCAN的治疗能力。完全激活的SCAN将M2巨噬细胞重极化为M1巨噬细胞，达到与游离R837相似的水平，M1巨噬细胞数量分别比PBS和未激活的SCAN（仅超声预照射）高4.4倍和3.1倍。然后，在所有组中加入完整的SCAN进行声余辉检测。完全激活的扫描处理细胞的声余辉强度比PBS和未激活的扫描高7.6倍和3.8倍。因此，这些数据验证了SCAN具有作为双锁定智能治疗剂的潜力，可以实现精确的M1极化免疫治疗和治疗结果的sonoafterglow读数。为了证明SCAN在体内的精确免疫治疗能力，提出了一种治疗方案，并在皮下4T1荷瘤小鼠中进行了测试。SCAN- c（不含Pro-R837的SCAN）作为对照。在MB近红外荧光显示的最佳肿瘤积累（0.5天）时，检测超声余光以评估肿瘤内生性M1特征的促炎性水平，随后长期超声应用（5分钟）诱导扫描产生1O2并激活Pro-R837，用于M1巨噬细胞极化超声免疫治疗(根据体外1O2生成和Pro-R837活化动力学)。在第2天，由于SCAN成分的消耗，声纳余辉信号回落到基线水平，这表明需要多次剂量的SCAN。因此，给予新剂量的SCAN，并检测声余辉，并与先前的SCAN剂量进行比较。顺序扫描成像声余辉强度的差异定义为ΔS，并用于与每次治疗后肿瘤M1特征的促炎状态水平升高相关。这些步骤被重复以形成一个治疗周期，允许密切监测SCAN的免疫治疗结果。与第一次给药后（第0天）相比，第二次给药后，超声余辉强度增加了4.82倍（第2天，ΔS = 3.0 × 105 ps−1 cm−2 sr−1,P < 0.001），第三次给药后，超声余辉强度增加了1.74倍（第4天，ΔS = 2.8 × 105 ps−1 cm−2 sr−1,P < 0.001）。这些结果表明，三剂SCAN可改善肿瘤促炎状况，这可能与M1巨噬细胞数量增加有关。然而，ΔS在第四次剂量后无显著统计学差异（ΔS = 2.8 × 104 ps−1 cm−2 sr−1,P > 0.05），提示SCAN可能不再改善促炎肿瘤微环境；因此，这种治疗方案被终止。因此，在第8天，SCAN +超声治疗诱导的声余辉强度比SCAN- c +超声治疗和SCAN组高1.8倍和3.3倍，这表明联合声动力免疫治疗（SCAN +超声）提高了M1取向的巨噬细胞极化水平。
总结
我们已经报道了一个用于活体动物深层组织诱导和无背景光学成像的超声诱导余辉纳米颗粒（SNAPs）库。凭借模块化的声余辉机制，SNAPs可以发展成为可激活的治疗纳米探针，用于准确检测病变微环境中细微的分子变化，并纵向监测治疗结果以指导干预。除了在体内药物筛选和精准医疗方面的潜力之外，声余辉成像的组织深度可能为实时无创检测生理病理过程提供机会，其灵敏度水平和组织深度是其他光学模式无法实现的。
参考文献
Nanoparticles with ultrasound-induced afterglow luminescence for tumour-specific theranostics，Cheng Xu, Jingsheng Huang, Yuyan Jiang, Shasha He, Chi Zhang & Kanyi Pu ，Nat. Bio. Eng，https://doi.org/10.1038/s41551-022-00978-z
