内容提要
我们设计了一种活化的余辉/MRI探针作为伴诊工具，用于动态评估放射治疗期间生物标志物APE1 （APE1）。我们采用超亮余辉纳米颗粒和超小的FeMnOx纳米颗粒作为双造影剂，显著拓宽了信号变化范围，提高了APE1成像的灵敏度。我们设计了纵向和横向减影增强成像（L&TSEI）策略，以显着提高活体雌性小鼠肿瘤和正常组织的MRI对比度和信噪比。余辉和MRI的结合有助于APE1活性的解剖和功能成像。该探针将余辉和MRI信号与APE1表达、辐射剂量、肿瘤内ROS和DNA损伤相关联，可以早期预测放疗结果（早在3小时），显著提前肿瘤缩小（6天）。通过监测APE1水平，这种探针可以早期和敏感地检测肝器官损伤，优于组织病理学分析。此外，MRI评估APE1在辐射诱导的体外效应中的表达。
APE1激活核心-卫星纳米探针的程序化自组装
为了实现高灵敏度的余辉成像，我们在前人报道的基础上合成了三蒽衍生物（TA）。通过MALDI-TOF质谱证实了TA分子的成功合成。通过采用电子转移策略，我们大大提高了余辉的发光强度。随后，我们利用富电子三蒽分子、半导体聚合物（PFODBT）、聚甲基丙烯酸酯（PSMA）和聚乙烯-聚丙烯乙二醇聚合物（F127），通过一步纳米沉淀法合成了余辉纳米颗粒（TA NPs）。PFODBT的加入增强了纳米颗粒的结构刚度。采用PSMA在TA NPs表面引入羧基，进行后续修饰。通过透射电子显微镜（TEM）图像测定，制备的TA NPs的平均直径为34±8 nm。助教的平均水动力大小NPs在水中测量与电动电势38±3.9 nm−18±1.8 mV。此外,TA NPs表现出最大吸收波长的荧光发射波长595 nm和630 nm。为了表征TA NPs的余辉发光，我们初步优化了激发余辉信号的辐照参数。白光照射时间为0 ~ 60s (10 mW/cm2, 0 ~ 60s)，采集时间固定为60s，以促进余辉信号的产生。结果表明，激发最强余辉发光的最佳照射时间为10 s 。此外，为了确定合适的采集时间，我们将采集时间从1到100 s不等，同时保持固定的10 s照射时间（10 mW/cm2）来采集余辉信号。观察到，在采集时间为60 s时，获得了更稳定、更强的余辉信号。此外，随着功率密度的增加，TA NPs在余辉信号中表现出相应的增强。此外，为了确定余辉发光信号的半衰期，以10 s的辐射时间照射TA NPs，以60 s的采集时间采集余辉信号。连续获取的余辉图像显示，TA NPs的持久余辉发光在停光后持续超过60分钟，半衰期延长至~15分钟。这种半衰期甚至比常见的余辉材料更长，例如基于mehppv的纳米颗粒，其半衰期约为6分钟。最后，我们通过10个光照射周期给TA NPs充电，观察到TA NPs的最大余辉强度没有出现任何明显的衰减，确保了在长时间和重复的分子成像过程中对余辉信号的准确量化（。值得注意的是，与常见的有机余辉分子（如MEHPPV或其类似物）相比，余辉NPs表现出超强的余辉发光，明显高于基于mehppv的纳米颗粒。接下来，我们通过交联反应用氨基标记的DNA1修饰TA NPs。与游离的TA NPs-COOH相比，DNA1在260 nm处的吸收强度增强，证实了TA NPsDNA1的成功制备。此外，动态光散射（DLS）分析显示，直径增加到48.4 nm±4.0 nm。根据过量DNA1在260 nm处的吸光度，确定DNA1/TA NPs的修饰比为250 mmol DNA1/2 g TA NPs 。为了合成磁性纳米颗粒作为MRI造影剂，以铁酸盐和油酸锰为原料，通过热分解制备了超小的FeMnOx 37。TEM图像显示，合成的FeMnOx的平均直径为3.4±0.9 nm，对应于CHCl3中的DLS尺寸为3.2±0.2 nm。此外，更多的表征如x射线衍射（XRD）、x射线光电子能谱（XPS）、能量色散x射线分析（EDX）等，进一步证实了FeMnOx纳米颗粒的成功制备。随后，用磷酸化/叠氮化聚乙二醇（p-PEG-N3）和2-溴-2-甲基丙烷酸（BMPA）通过配体交换过程修饰FeMnOx- n3，再用氨基修饰的BHQ3猝灭剂分子（H2N-BHQ3）修饰FeMnOx- n3，形成FeMnOx@BHQ3-N3。制备成功后，疏水的FeMnOx（黄色）转变为亲水的FeMnOx@BHQ-N3（绿色）。FeMnOx@BHQ3-N3在600 nm波长处对BHQ3有明显的吸光度，平均水动力直径为9.6±0.8 nm，电势为−14±0.2 mV。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示BHQ3在FeMnOx上的共轭作用。
我们使用7T-MRI扫描仪确定FeMnOx@BHQ-N3的MRI对比能力。从MRI图像来看，随着FeMnOx浓度的增加，单分散FeMnOx@BHQ-N3在T1 MRI图像中显示亮度增加（正对比），而在T2 MRI图像中显示黑暗（负对比），提示T1 MRI和T2 MRI的对比能力。
随后，FeMnOx@BHQ3-N3通过点击反应与烷基标记的DNA2 （alkyne-DNA2）偶联，形成DNA2功能化的FeMnOx@BHQ3-N3 (FeMnOxDNA2)。FeMnOx-DNA2的制备证实了DLS尺寸增加到12.9±1.1 nm， zeta电位降低到−16.1±1.4 mV。基于DNA1和DNA2的杂交，我们将TA NPs-DNA1与FeMnOx-DNA2组装，形成TA NPs和FeMnOx的核心-卫星组装，命名为APE1-probe。通过TEM图像验证了ape1探针的制备，发现其为核心-卫星结构，其中晚霞NPs为核心，多个FeMnOx作为卫星紧密附着在TA NPs表面。DLS分析确定的平均直径为83.0±7.2 nm，电位为−37±2.6 mV，并且在观察的时间内，在不同的缓冲液中表现出优异的胶体稳定性。
由于FeMnOx@BHQ3的吸收与TA NPs的余辉发光之间的光谱重叠，多个FeMnOx紧密附着在TA NPs表面，通过余辉共振能量转移（ARET）将相邻的BHQ3分子淬灭TA NPs的余辉信号。为了证实这一点，我们比较了TA NPsDNA1与FeMnOx-DNA2组装前后的余辉信号强度。正如预期的那样，TA NPs的余辉发光被FeMnOx-DNA2中的BHQ3分子显著猝灭至~95.0±3.0%，表明是FeMnOx-DNA2。在响应前减小余辉信号有利于减小初始余辉信号，提高信噪比，扩大动态范围。此外，我们优化了TA NPs-DNA1和FeMnOx-DNA2的组装比例。我们观察到，随着FeMnOx-DNA2与TA NPs-DNA1组装比例的增加，余辉信号减弱。根据余辉信号，我们选择25 μg FeMnOx-DNA2/2 μg TA NPsDNA1作为后续实验中ape1探针制备的合适配比。
余辉核-卫星探针和APE1活性MRI成像的动态范围和灵敏度
在设计DNA序列中具有ape1可切割的apurinic/apyrimidinic （AP）位点时，ape1可切割的AP位点位于ape1探针的核心-卫星结构之外。我们假设这种结构会降低催化位点的位阻，从而提高ape1介导的裂解效率，因此，当核心-卫星结构外的DNA1- dna2区域的双链遇到APE1酶时，DNA1中的AP位点被APE1迅速切割。这种裂解导致FeMnOx@BHQ3的释放，由于TA NPs和FeMnOx@BHQ3之间的ARET效应被破坏，这有利于余辉信号的快速恢复。此外，从ape1探针中释放FeMnOx导致其分散释放自由的FeMnOx纳米颗粒，有助于增强t1加权MRI的正对比（表现为亮度增加）和增强t2加权MRI的负对比（导致更大的黑暗）。我们将APE1探针与APE1酶（10 U/mL）孵育，并测量其水合直径的变化。如图所示，与APE1孵化能使APE1探针的平均DLS尺寸从原始的APE1探针的83.0±7.2 nm减小到49.7±4.1 nm，证实了APE1可以通过切割AP位点触发APE1探针的拆卸。为了进一步研究APE1对余辉信号恢复的依赖性，我们用不同浓度的APE1孵育APE1探针，浓度范围为0 ~ 10 U/mL。孵育4 h后，在生物发光模型下，光照射10 s后，使用IVIS Lumina XR成像系统检测余辉信号。随着APE1浓度的增加，余辉发光逐渐增强，说明APE1可以通过切割AP位点，破坏TA NPs与FeMnOx@BHQ3之间的ARET效应，逐步激活APE1探针恢复余辉信号。在APE1 （4 U/ mL）条件下，余辉信号恢复率为28.0±2.0%。
由于TA NPs的超高余辉发光，当APE1浓度从0增加到10 U/mL时，回收的余辉信号范围可达到~106。这种广泛的余辉信号恢复动态范围有助于在大范围内检测APE1，而不会有信号饱和的风险。因此，它能够在生物条件下精确测量APE1浓度。此外，在0 ~ 4 U/mL范围内，余辉信号的增加与APE1浓度呈近似线性关系。利用公式（3σ/k）计算出APE1酶的检出限为0.0092 U/mL。该值明显低于大多数用于APE1检测的荧光探针。重要的是，随着余辉信号的恢复，信噪比呈增加趋势。综上所述，APE1探针可以通过余辉信号恢复检测到APE1，提供更宽的信号范围（~106），更宽的APE1检测范围（0 ~10 U/mL），提高了检测灵敏度（检测限：0.0092 U/mL）。
为了提高MRI检测APE1的灵敏度，我们选择了超小型的FeMnOx作为MRI造影剂。FeMnOx在T1和T2 MRI模型中均表现出双重对比能力。具体来说，当使用响应APE1的核心-卫星探针时，FeMnOx纳米颗粒从探针的核心分离，导致随着APE1浓度的增加，在T1和T2 MRI模型中都表现出双重对比能力。采用Bruker Minispec分析仪（60 MHz）和7 T MRI扫描仪进行实验，观察APE1探针响应APE1时MRI信号的变化。弛豫时间结果表明，随着APE1浓度从0增加到10 U/mL， APE1探针的T1和T2弛豫时间逐渐减小。这导致1/T1从3.1 s−1增加到10.6 s−1,1/T2从5.9 m−1增加到84.8 s−1。
为了进一步研究MRI对比增强，我们获得了不同浓度APE1处理的APE1探针的MRI图像。由于FeMnOx的应用，初始的APE1探针（0 U/mL的APE1）没有明显的MRI对比，这有助于降低正常组织中APE1探针本身的背景噪声。相反，在APE1孵育后，随着APE1浓度从0增加到10 U/mL， T1 MRI图像显示正对比增强（亮度增加），T1 MRI信号强度升高。
相反，T2 MRI图像逐渐变暗，表明对比度呈负增强，T2 MRI信号强度下降。此外，我们采用7 T MRI扫描仪，使用T1或T2映射序列测量APE1探针对APE1的反应时弛豫时间的变化。彩色编码的映射图像显示，在APE1处理后，与未处理APE1相比，不同浓度探针的T1和T2弛豫时间值都有所下降。此外，在溶液测试中，APE1探针对APE1表现出较高的选择性。
考虑到T1和T2 MRI信号强度呈反比变化，将T2 MRI信号强度减去T1 MRI信号强度可显著增强MRI信号变化的动态范围40,41，从而提高APE1的灵敏度和检测范围。由此，我们计算出当APE1浓度从0增加到10 U/mL时，MRI T1信号的增加（ΔT1值）和T2信号的减少（ΔT2值）。因此，将ΔT1值与ΔT2值之间的MRI信号强度相减，计算出ΔT1 -ΔT2值。如图所示，与单个T1或T2 MRI信号~104相比，ape1探针的ΔT1 -ΔT2值被显著放大至~105。这种放大的反应信号大大增强了MRI的灵敏度。值得注意的是，在0 ~ 2 U/mL范围内，ΔT1 -ΔT2值与APE1浓度之间存在密切的线性关系，如图所示。据此计算出APE1的检出限为0.16 U/mL。相比之下，使用单个ΔT1值或ΔT2值与APE1相关，其检出限分别为0.36 U/mL和0.27 U/mL。因此，与单一T1 MRI信号或单一T2 MRI信号进行APE1量化相比，将T2 MRI信号减T1 MRI信号可将MRI动态范围从104放大至105，扩大APE1检测范围（0 ~ 10 U/mL），提高检测灵敏度（检测限：0.16 U/mL）。
超细氧化铁纳米颗粒（FeOx）在T1 MRI成像研究中被报道为阳性造影剂。我们还比较了MRI成像研究中常用的T1造影剂FeOx的MRI造影剂效果。在本研究中，我们使用超微FeOx纳米颗粒（3.9±0.5 nm）作为对照组，以证明FeMnOx在我们设计的系统中的优越性能。我们比较了FeOx和FeMnOx纳米颗粒的MRI对比效果。，随着FeOx浓度的增加，FeOx在T1和T2 MRI图像上的亮度都呈增加趋势。我们进一步探索了使用FeOx作为MRI造影剂合成TA NPs-FeOx，通过将FeOx- dna2与TA NPs-DNA1组装，如图34所示。最初，TA NPs-FeOx在T1和T2 MRI模型中均表现为阴性对比，直到APE1激活。激活后，TA NPs-FeOx在T1和T2 MRI模型中均显示出阳性的成像能力（图3m）。然而，值得注意的是，MRI信号强度随着APE1浓度的增加而同步增加（图3n），因此与TA NP-FeMnOx相比，从T2 MRI信号强度中减去T1 MRI信号强度（ΔT1 -ΔT2）不会扩大MRI的动态范围。
此外，TA NPs-FeOx的ΔT1 -ΔT2值与APE1浓度无关，提示TA NPs-FeOx的ΔT1 -ΔT2值不能用于量化APE1的浓度。这些结果证明了使用FeMnOx构建APE1探针的优越性，有助于更高的MRI对比度，更高的动态范围和更高的APE1检测灵敏度。
余辉/MRI成像对肿瘤放疗效果的早期预测
肿瘤的异质性和个体在人口统计学、种族和遗传因素方面的差异，需要重新考虑利用最大辐射剂量的传统的一刀切方法。因此，采用个性化的放射治疗方法是非常可取的，以提高治疗效果和减轻不良反应。这种个性化治疗可以通过评估与辐射及其毒性相关的特定分子生物标志物、表型或基因组学来实现。在这项工作中，考虑到肿瘤的异质性和肿瘤的个体差异，我们建议将MRI和余辉成像引导放射治疗相结合。放疗在癌症治疗中的应用是基于通过x射线照射产生细胞毒性ROS和DNA损伤，导致癌细胞凋亡。为了研究不同辐射剂量下x射线诱导的ROS和DNA损伤的产生，我们收集了放疗后的肿瘤样本进行染色。最初，使用细胞内ROS指示剂2 ',7 ' -二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）对肿瘤切片进行染色。通过分析共聚焦图像和相应的定量结果，我们观察到随着辐射剂量的增加，肿瘤切片的荧光信号逐渐增加。这一发现表明，较高的辐射剂量可增强肿瘤内ROS的生成。我们利用肿瘤切片上的H2AX抗体染色，通过免疫荧光分析评估肿瘤内DNA损伤水平。共聚焦图像分析和定量分析表明，辐射剂量越高，荧光信号升高，表明DNA损伤越严重。鉴于肿瘤内DNA损伤和ROS的产生可刺激APE1的上调，从而平衡细胞内氧化还原环境，促进DNA修复，我们用APE1抗体染色肿瘤切片以检测其表达。共聚焦图像和定量结果显示，随着辐射剂量从0到6 Gray的增加，肿瘤切片内荧光信号逐渐增加，证实了APE1的辐射剂量依赖性上调。我们通过将HeLa肿瘤小鼠置于不同的辐射剂量（0、2、4和6 Gray）并跟踪肿瘤生长12天来监测肿瘤的生长。照射后第12天的肿瘤生长曲线分析和肿瘤重量测显示，与对照组相比，2 Gray的辐射剂量诱导肿瘤生长部分抑制。4 Gray放射治疗对肿瘤生长的抑制作用更大，而6 Gray放射治疗对肿瘤生长的抑制作用更明显。此外，在h&e染色和TUNNEL图像中观察到的组织学损伤进一步证实了高辐射剂量与更明显的治疗结果相关的发现，支持辐射剂量依赖性反应的概念。我们为这些参数创建一个热图。热图显示，辐射剂量与APE1探针中余辉和MRI信号增强、ROS生成增加、肿瘤内DNA损伤和APE1表达增加呈良好的正相关关系。这意味着余辉和MRI成像可以追踪放射治疗期间APE1的动态水平，这有利于评估ROS的产生、肿瘤内DNA损伤和预测治疗结果。此外，我们的研究结果表明，余辉和MRI成像早在照射后3小时就可以检测到APE1水平的变化，而基于肿瘤大小的治疗结果只能在6天后观察到。这突出了早期APE1检测在预测放疗结果方面的潜在效用。未来的研究可以集中在探索探针在指导个性化放疗策略和提高治疗效果方面的潜力。
参考文献
Imaging-guided companion diagnostics in radiotherapy by monitoring APE1 activitywith afterglow and MRI imaging，Renye Yue, Zhe Li,HuiyiLiu, Youjuan Wang,YuhangLi,RuiYin,BaoliYin,Haisheng Qian, Heemin Kang ,Xiaobing Zhang &GuoshengSong， Nat. Commun| (2024) 15:6349， https://doi.org/10.1038/s41467-024-50688-0
