内容提要
本文报道了一系列含草沙啶的供体-受体阻滞半导体聚合物（PDCDs）的合成，并观察了它们的高光反应性和强近红外（NIR）余辉发光。我们发现pdcd吸收近红外光，经过光动力学过程生成单线态氧（1O2），由于该光反应所需的低吉布斯自由能变化，分子内转移到并有效地与草酸苷块反应，形成余辉草酸苷中间体。随着分子内余辉能量从草酸嘧啶供体区转移到受体区，pdcd产生近红外余辉发射。由于高效的级联分子内光化学过程，与大多数报道的余辉剂相比，基于pcd的纳米颗粒即使在仅3秒的超短光照射后也能获得更高的亮度和更长的近红外发射。此外，PDCD内的级联光化学过程在与猝灭肽结合后可以被抑制。这允许构建一个癌症激活的余辉治疗探针（CATP），它只在癌症过表达酶存在的情况下打开余辉信号和光动力学功能。
余辉聚合物的合成及机理研究
首先通过在甲苯中与2-巯基乙醇反应1,2-二（4-溴苯基）-2-羟乙烷酮合成了草硫嘧啶单体DDO（。然后以不同的进料比(1:1:0；0.95:1:0.05;0.90:1:0.10;0.75:1:0.25;和0.50:1:0.50)形成能量供体（DDO-CPDT块）和能量受体（DBT-CPDT块）。对应的SPs分别命名为PDCD0、PDCD5、PDCD10、PDCD25和PDCD50，其中0 ~ 50表示引入DBT含量的百分比。在两亲性三嵌段共聚物（F127, PEG-b-PPG-b-PEG）的存在下，采用共纳米沉淀法将5个pdcd转化为水溶性半导体聚合物纳米粒子（SPN0−SPN50）。通过动态光散射（DLS）测量spn的水动力直径，范围为20 ~ 40 nm。所有spn在430 nm处都有一个相似的特征吸收峰，与DDO-CPDT块对应。DBT存在时，SPN5−SPN50在610 nm处出现另一个吸收峰，其强度随着DBT含量的增加而增加。此外，这些含dbt的spn表现出较大的斯托克位移，近红外荧光发射最大值在773 ~ 818 nm之间，与SPN0 （614 nm）相比，SPN5（159）、SPN10（172）、SPN25（188）和SPN50 （204 nm）红移。这种红移发射归因于分子内荧光共振能量从DDO-CPDT供体块转移到DBT-CPDT受体块。含dbt的spn的广泛近红外吸收使我们能够应用具有深层组织穿透能力的近红外激光（660 nm）来诱导余辉，这对于SPN0来说几乎是不可能的，因为它的最大吸收在430 nm。在低功率密度为0.06 W/cm2的超短近红外激光照射3 s后，含dbt的SPNs（即SPN5−SPN50）表现出强烈的近红外余辉，光谱分布接近于其荧光。随着DBT浓度从5%增加到50%，引入DBT的SPNs的余辉发射最大值从760 nm红移到820 nm。SPN5−SPN25在低浓度为50 μg/mL（如SPN10为3.6 × 108 p/s/ cm2 /sr）时，其近红外余辉强度可达108等，而SPN50的信号强度则急剧下降，比SPN10低7.7倍。
癌症特异性余辉治疗探针的合成及体外研究
为了实现精确的癌症诊断和治疗，PDCD10被选中开发一种具有最佳余辉行为的智能癌症激活探针CATP。之所以选择一种癌症生物标志物（CatB），是因为它在多种癌细胞中表达上调，在肿瘤生长和进展中发挥作用 CATP由四个关键片段组成：余辉光疗片段（PDCD10）、亲水性片段（PEG2K）、catb可切割肽片段（Cit-Val序列）和猝灭片段（BBQ-650）。首先，在catb可切割肽上引入炔基，然后将其与叠氮修饰的BBQ-650偶联，得到淬灭剂连接肽valcat -BBQ-650。然后，将其与一端为炔基，另一端为羧基的聚乙二醇链（MW = 2000）通过酰胺键偶联，得到炔基修饰的聚乙二醇化catb可切割猝灭物（alkyne - peg2k - valctc - bbq -650）。用叠氮基团修饰PDCD10得到PDCD10N3，再与Alkyne-PEG2K-ValCit-BBQ-650和Alkyne-PEG2K-OMe按1:3的摩尔比进行点击反应得到CATP， CATP可自组装成纳米颗粒。所有化合物的化学结构均经ESI-MS和NMR证实。透射电子显微镜（TEM）显示CATP呈球形形态，DLS测量下的水动力尺寸为35.2 nm。CATP用于活化后辉光疗的形态如图所示。在没有CatB的情况下，连接BBQ-650的猝灭作用抑制了CATP的级联光化学过程。只有在CatB存在的情况下，肽段被裂解释放出BBQ-650，终止了其猝灭作用，使CATP在超短（3 s）近红外光预照射（“ON”状态的余辉）和长（7 min）光照射（“ON”状态的PDT）后进行余辉发光。
在溶液和细胞中测试CATP的特异性catb活化发光。与CatB孵育后，发现了ValCit-BBQ-650的裂解片段（即NH2 -BBQ-650）， CATP在780 nm的近红外余辉增加了108.6倍，而CATP在780 nm的近红外荧光仅增加了6.3倍。CATP对CatB的选择性优于其他酶，如碱性磷酸酶（ALP）、氨基肽酶（APN）、β-半乳糖苷酶（β-gal）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）、呋喃、γ -氨酰基转移酶（GGT）、硝基还原酶（NTR）和尿激酶纤溶酶原激活剂（uPA）。此外，添加CatB抑制剂（CA-074）后，停止光照射后CATP的近红外荧光和余辉信号均低于单独CATP。此外，与CATP孵育12小时后，4T1癌细胞的近红外荧光和余辉比用CatB抑制剂预处理的癌细胞高4.0倍和56.0倍。余辉成像比荧光成像的倍数增强高可归因于荧光成像下的自身荧光，显示了无背景近红外余辉成像相对于荧光成像的优越性。通过SOSG法测定1O2的生成，评价CATP的catb活化光动力效应。近红外光照射5min后，CATP溶液中SOSG的荧光信号经过CatB孵育后增强了2.75倍。此外，在相同的照射条件下，用2 ',7 ' -二氯二氢荧光素双乙酸酯（H2DCFDA，细胞内ROS的荧光指示剂）染色的catp处理的细胞的荧光比用CatB抑制剂预处理的细胞高39.6倍。当CATP浓度达到100 μg/mL时，无论是否进行抑制剂预处理，CATP本身均表现出较高的细胞相容性；然而，在光照下，CATP导致细胞活力随着CATP浓度的增加而显著下降（100 μg/mL时细胞活力下降33.4%），而对抑制剂预处理的细胞和catb阴性的3T3细胞没有明显的毒性。这些结果验证了CATP具有特定的catb活化光动力活性。
活体癌症特异性余辉疗法
在4T1荷瘤小鼠皮下观察CATP的肿瘤特异性余辉治疗能力。4T1肿瘤植入7天后，小鼠静脉注射CATP进行96 h的纵向近红外余辉和荧光成像。肿瘤的近红外余辉和荧光信号均增加，并在注射后48 h达到最大值。在这个时间点，这些信号分别比CatB抑制剂预处理的小鼠高6.9倍和1.7倍，这证实了CatB可激活的余辉成像在体内。此外，由于余辉的背景噪声低，余辉成像的SBR（257.8）比近红外荧光（6.67）高38.7倍。注射96 h后分析CATP的生物分布。离体余辉和荧光成像均显示，CATP在肿瘤中有效积累，信号强度最高，其次是肝脏。此外，免疫荧光染色显示CATP的荧光信号与CatB抗体的荧光信号共定位良好，而CatB抑制剂预处理组没有观察到明显的CATP荧光信号，进一步说明CATP在体内存在CatB时被激活。
在确认CATP注射后48 h肿瘤蓄积最高后，于第2天采用近红外光（0.2 W/cm2，照射7 min）对肿瘤进行PDT。与未光照的CATP对肿瘤的抑制作用相比，CATP介导的PDT对肿瘤的抑制作用可以忽略不计，在所有治疗组中，CATP介导的PDT对肿瘤的抑制率最高，为92.2%。此外，在近红外光照射前，将SOSG注射到catp处理的小鼠瘤内，产生的荧光信号比生理盐水处理的小鼠亮10.6倍。
总结
在低功率密度（660 nm, 0.06 W/cm2, 3 s）的超短近红外光照射下，我们合成了一系列由DDO-CPDT和DBT-CPDT组成的含草酸硫的供体-受体块体SPs，发现它们具有高光反应性和极亮且可调的近红外光余辉。DDO-CPDT嵌段与1O2的反应中，草酸嘧啶中间体的快速生成和分解（ΔG =−131.6 kcal/mol）， DDO-CPDT给体嵌段与DBT- cpdt受体嵌段之间的有效分子内AET，即使DBT含量低至5%(如5.0 × 106 (p/s/cm2 / sr)/(μg/mL)， SPN5为760 nm)，基于pdcd的SPNs也表现出较强的近红外余光。DBT含量的增加导致DBTCPDT的π共轭增强，使spn的余辉发射进一步红移（如SPN50的余辉发射为820 nm）。据我们所知，与所有现有的单分子自余辉剂相比，我们设计的基于pdcd的高光反应性SPNs具有最高的亮度(例如，SPN10为7.2 × 106（p/s/ cm2 /sr)/(μg/mL)）和最长的发射（例如，SPN50为820 nm）。其中，SPN10表现出最亮的近红外余辉和最有效的1O2生成，并进一步发展成为第一个具有生物标志物（CatB）激活余辉信号和光动力生成1O2的智能癌症特异性余辉治疗探针（CATP）。得益于生物标志物的特异性，CATP能够精确地在体内检测肿瘤，其余光SBR为257.8，并进行有效的肿瘤PDT，肿瘤抑制率为92.2%。
参考文献
Highly Photoreactive Semiconducting Polymers with Cascade Intramolecular Singlet Oxygen and Energy Transfer for CancerSpecific Afterglow Theranostics,Youshi Lin, Jingsheng Huang, Jing Liu, Mengke Xu, Cheng Xu, and Kanyi Pu*,J. Am. Chem. Soc.,https://doi.org/10.1021/jacs.4c14565
