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内容提要

   本研究中我们对人血清白蛋白（HSA）具有特异性结合能力的近红外（NIR）化学发光体，以形成化学发光体 - 蛋白质复合物，用于癌症检测和光动力治疗。与 HSA 复合后，化学发光体的化学发光（CL）强度增强了 10 倍以上；同时，光动力过程从以生成单线态氧为主的 II 型转变为以生成超氧阴离子和羟基自由基为主的 I 型。基于优化的化学发光体，我们合成了一种硝基还原酶激活的 CL 探针 - 蛋白质复合物，该复合物可在缺氧肿瘤中特异性开启其 CL 和 I 型 PDT，实现精准治疗。

   我们通过修饰 Schaap 的二氧杂环丁烷骨架，获得了具有特定蛋白质靶向结构（N - 乙基罗丹宁部分）的近红外化学发光体（EDP_O和EDP_S）。通过前体的光敏氧化反应合成相应的化学发光体，并在化学发光体碱性处理后获得活化形式。由于 HSA 与 N - 乙基罗丹宁部分的高亲和力，化学发光体 - 蛋白质复合物（HEDP_O和HEDP_S）可通过将相应的化学发光体与 HSA 混合轻松制备。研究两种荧光团与蛋白质结合前后的光物理性质，并以已报道的DBP_O与人血清白蛋白（HSA）非特异性结合前后的光物理性质作为标准参照。EDP_X和HEDP_X所示（X=O和S）的最大吸收波长分别为490和505 nm，而DBP_O和HDBP_O的最大吸收波长分别为537 nm，HEDP_O和HEDP_S的化学发光较无蛋白的荧光团有轻微的蓝移，最大吸收波长分别为700和720 nm（EDPO：720 nm; EDP_S：740 nm），而HDBP_O的CL光谱与DBP_O的CL光谱完全一致两种复合物的所有CL光谱与HSA结合活化形式的相应FL光谱完全一致。在分子间化学引发的电子交换发光（CIEEL）过程之后，两个HEDP_X（X=O和S）的CL信号比EDP_X高10倍以上，而HDBP_O的CL强度仅比DBP_O高约4倍，这可能是由于具有特异性结合的蛋白质口袋可以有效地抑制扭曲分子内引起的非辐射衰变。电荷转移以增强激活形式的FL信号。注意到Lippert和Doron的研究小组也报告了荧光团在与胎牛血清相互作用时增加了其发射强度。疏水口袋也可以稳定二氧杂环丁烷结构，避免了快速分解，并将HEDP_X（X=O和S）的半衰期分别延长至约105和93 min，而EDP_X本身的半衰期分别仅达到约37和29 min。

   为了进一步研究HEDP_O与蛋白质的相互作用，测定了HEDP_O与HSA结合的选择性和结合动力学，结果表明HEDP_O与HSA结合后产生的化学发光信号最强（牛血清白蛋白：BSA;小鼠血清白蛋白：MSA;和兔血清白蛋白：RSA），而与PBS中没有任何蛋白结合的EDPO相比，所有蛋白处理组均显示出更高的CL信号。在给定条件下，估计EDPO和HSA之间的结合比约为1：1。EDPO和HSA的动力学结合常数通过滴定法测定，结果为8.38×10⁵ M^-1，显著高于EDPO和BSA之间的差异（1.16×10⁵ M ^-1），表明EDPO对HSA具有上级亲和力。分子对接模拟显示，EDP_X的硫酮基团通过与ARG-410的氢键结合和疏水相互作用与HSA的Sudlow位点II结合，证明了与HSA的报告结合能（7.3 kcal/mol）相比更强的结合能（8.0 kcal/mol）。

   随后检查并比较了活化形式（AEDP_X和HAEDP_X）的光动力活性。ROS传感器DHR 123、HPF和SOSG分别用于检测O₂·、·OH和¹O₂的产生。对于HAEDP_X，在白色光照射下，DHR 123和HPF的FL强度分别逐渐增加，表明I型ROS产生。与此相反，光照射AEDP_X产生的I型ROS可以忽略不计，但与I型ROS产生的趋势不同，（X=O和S）分别增加了3.0倍和4.6倍，而光照射HADBP_O则产生了微量的I型活性氧HADBP_O和ADBP_O具有明显的II型活性氧产生（¹O₂）。在HAEDP_X中，HSA通过限制分子内运动增强系统间穿越（ISC）过程，AEDP_X的硫酮取代基可进一步促进ISC，HSA可调节邻近电子密度，从而为I型ROS提供电子转移反应所需的电子然而，由于没有特异性结合，HSA和ADBP_O之间没有发生电子转移反应。在评估CL成像和PDT能力后，选择具有突出CL信号和最佳I型PDT的HEDP_O用于进一步应用。

   为了实现对癌细胞的特异性检测，开发了一种可NTR激活的荧光探针-蛋白质复合物（HEDPN）。具体地，HEDPN是通过用4-硝基苄基溴将EDPO的苯酚羟基笼化，然后与HSA结合得到最终的目标复合物。所有化合物的结构通过¹H、¹³ C NMR和LC-MS分析确认。

   为了研究HEDPN的传感能力，测量并比较了NTR活化前后的CL光谱。在NTR裂解后，HEDPN被活化以显示跨越可见光和NIR I区域（λ 650 nm）的红移和加宽的吸收。此外，加入NTR后，HEDPN的初始最小CL信号逐渐增加，最终在~700 nm处达到88.6倍增强。相比之下，其FL信号仅增加约3.0倍如通过高效液相色谱（HPLC）分析验证的，在13.0分钟出现新的HPLC峰，对应于活化形式（AEDPN），证实了NTR触发的HEDPN的切割机制。HEDPN还证明了对NTR的上级选择性优于其他酶（ALP、Cas 3、弗林蛋白酶、GGT、β-gal、uPA或NTR+抑制剂）。这里，双香豆素作为NTR的竞争性抑制剂，通过与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）直接竞争来干扰其酶活性。此外，HEDPN对NTR的检测限（LOD）测定为约0.15 μg/mL，低于其他报道的荧光探针。

   为了评估HEDPN对细胞培养基中NTR的检测能力，在与4 T1细胞孵育后测量CL和FL信号，HEDPN的CL信号相对于抑制剂组表现出15.7倍的增强，而FL仅增强2.1倍。在NTR酶缓冲溶液和NTR过表达的4 T1细胞培养基中评估了NTR激活的HEDPN的I型光动力学活性。在与NTR溶液孵育之前和之后，通过使用相应的ROS传感器测量HEDPN产生的不同ROS。HEDPN表现出扩展到NIR I区域的吸收光谱。因此，与未活化的HEDPN相比，NIR光照射活化的HEDPN导致O₂·和· OH产生分别增加2.1倍和1.7倍然而，NT R活化和未活化的HEDPN都显示出可忽略的¹O₂产生。另外，HEDPN在缺氧条件下即使在100 μM的高浓度下也没有显示暗细胞毒性，但对4 T1细胞表现出显著的光毒性利用2 '，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2 DCFDA，ROS荧光指示剂）检测HEDPN处理的细胞中ROS的产生。在NIR照射的HEDPN处理组中观察到明显的H2 DCFDA的绿色信号，表现出比抑制剂组中的信号增强5倍。这些结果表明，HEDPN在细胞水平上显示出NTR可激活的I型光疗，表明其在体内精确治疗应用中的潜力。

   为了评价探针-蛋白复合物HEDPN在体内诊断和治疗的效果，在4 T1荷瘤小鼠中纵向进行CL成像和PDT治疗。在4 T1肿瘤植入后7天，将HEDPN局部施用到小鼠皮下肿瘤中，随后进行实时CL成像和随后的PDT。肿瘤的CL信号显示出快速增加，在瘤内注射（IT）HEDPN后30分钟达到平台期;在这个时间点，它显示出比给药组高3.2倍此外，来自肿瘤部位的CL信号微弱，但在注射HEDPN后180分钟后可检测到。HEDPN-光处理的小鼠肿瘤生长被完全抑制，而在其他组中没有观察到显著的肿瘤抑制。此外，在所有给药组中，小鼠体重和其他主要器官（包括心、肺、肝、脾和肾）均无显著变化，证明了HEDPN在小鼠中的生物安全性。为验证HEDPN的I型光动力疗法的有效性，采用DHR 123检测肿瘤组织中I型活性氧的产生。HEDPN光处理组肿瘤切片中观察到明显的绿色荧光信号，而其他组肿瘤切片中观察到微弱或可忽略的绿色荧光信号根据苏木精和曙红（H&E）和免疫荧光分析，相对于其它对照组，仅HEDPN光处理组显示明显的细胞死亡和更高的半胱天冬酶-3（凋亡生物标志物）表达。

总结

   本文合成了两种近红外荧光团与人血清白蛋白（HSA）特异性结合形成CL探针-蛋白复合物，两种复合物均与HEDPX结合后，（X=O和S）表现出超过10倍的CL信号增强，而非特异性结合HDBPO仅表现出~4倍的CL信号增强。在复合物中，HSA和硫酮取代基都能增强ISC过程。此外，富含电子的HSA可以提供电子进行电子转移反应以产生I型ROS，而与非特异性HSA结合的ADBPO不能改变光动力学性质。HEDPO显示出上级的CL成像和适度的I型ROS产生，这被选择用于构建可激活的I型光动力学复合物HEDPN。HEDPN仅被NTR酶特异性激活，在4 T1乳腺肿瘤小鼠模型中，复合HEDPN成功地应用于CL成像引导的I型PDT。

参考文献

Near-Infrared Chemiluminophore Switches Photodynamic Processes via Protein Complexation for Biomarker-Activatable Cancer Therapy，Jingsheng Huang , JingLiu, Jiayan Wu, Mengke Xu, Youshi Lin, and Kanyi Pu*，Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e202421962，http://doi.org/10.1002/anie.202421962