内容提要
本研究报道了一种新型的基于半菁的分子支架，其具有刺激响应性余辉发光特性，这依赖于氧气O2与余辉分子之间的分子内级联光反应，该反应能够储存光能，以便在光照停止后实现延迟发光。通过将刺激响应单元、氧气生成单元、氧气捕获单元和发光单元集成到一个探针中，定制了三种具有 “四合一” 分子设计的模块化可激活分子余辉探针（MAPs），用于对包括 pH、超氧阴离子和氨肽酶在内的目标物进行定量分析和成像。MAPs 在余辉成像中比在荧光成像中表现出更高的灵敏度，因为响应单元同时控制着荧光从S1到S0的起始和氧气从S1到T1的生成。最后，MAPs 被应用于药物诱导的肝毒性的高对比度余辉成像，这在临床和药物研发中难以得到有效评估。通过揭示氧化应激和氨肽酶上调的顺序发生，这类可激活的余辉探针能够在血清学和组织学表现之前对肝毒性进行无创成像。
结果与讨论
我们合成了半花菁染料（HD-H、HD-F、HD-Cl、HD-Br）以优化余辉性能。仔细比较这些HD的光学性质，它们在650 ~ 750 nm的近红外吸收峰和700 ~ 800 nm的荧光发射峰均相似，斯托克斯位移均为1.25 nm。在荧光下，用IVIS光谱成像系统收集HD的荧光和余辉信号。（在670 nm处激发）和生物发光如图所示，这些HD的荧光强度彼此接近，同时观察到它们的余辉强度的显著差异。HD-在相同条件下，Br的余辉发光强度最强，荧光量子产率最低，说明余辉发光与HD上的取代基有关因此，我们推测HD-Br的荧光量子产率的降低与激发态的非辐射弛豫途径的改善有关，这是由于溴的重原子效应。33之后，我们以SOSG和DPBF作为1O2产生的指标，比较了HDs的1O2产生能力SOSG在540 nm处的特征荧光峰显示出随照射时间的显著增强，并且DPBF在410 nm处的典型吸收峰显示出显著降低，表明在这些HD衍生物中，HD-Br在660 nm激光下的1O2产生能力最强。
我们进一步对单重态（S1）和三重态（T1）的能级进行了理论计算。HD-Br显示最小的ΔES 1-T1（0.7746 ev），表明从S1到T1的系间穿越最容易，这与最高的1O2产生能力相一致。为了消除母体分子产生1O2的作用，由于H2O2 − H2O2离子（Na2 MoO4）可以产生1O2，我们测试了不同的HDs在Na2MoO4 + H2O2混合溶液中的发光强度。由Na2MoO4 + H2O2激发的HD-Br的发光强度显著高于HD-H、HD-F和HD-Cl的发光强度，这表明HD-Br被1O2氧化的所得产物能够经历更强的化学发光发射。另外，在660激光照射下，HD-Br的余辉发光强度下降幅度最大，说明HDs的余辉发光受取代基的调控。
HD-Br的余辉发光机理
由于HD-Br具有最强的余辉发光强度，因此我们选择其作为余辉发光的基质，在后续的实验中，首先对影响HD-Br余辉发光的因素进行了优化，从余辉成像和定量结果来看，余辉发光强度与分子浓度和激光功率密度呈正相关，而观察到与暴露时间呈负相关。在10 ~ 120 s范围内，随着辐照时间的延长，余辉强度先增大后减小（从10到90秒），然后下降（从90到120秒）。提高保温温度有利于余辉发射的增强此外，在PBS/乙醇混合溶剂中的HD-Br呈现出比在其他溶剂中更强的余辉。
随后，我们研究了HD-Br的余辉发射带，HD-Br的发射通道主要位于510−570 nm处，如果通过纳米沉淀法将分子（HD-Br）掺入纳米颗粒中，纳米颗粒中HD-Br的余辉发射与相应的荧光发射相似（690− 770 nm）接下来，我们测量了HD-Br在O2或N2中的余辉发射强度。当在O2饱和溶液和N2饱和溶液中测量时，HDBr的余辉分别增加了1.6倍或减少了2.1倍，表明O2参与了余辉发射过程考虑到H2O2-钼离子（Na2MoO4）体系可以产生1O2，我们测试了与Na2MoO4、H2O2、如所预期的，由Na2MoO4 + H2O2激发的HD-Br的发光强度显著高于单独的PBS、Na2MoO4或H2O2的发光强度，这证实了余辉分子（HD-Br）确实可以由Na2O2激发。通过余辉图像的连续采集，HD-Br在光停止后的长余辉发光可以持续超过60分钟，在缓冲溶液（pH = 7.4）中的半衰期延长至102分钟。
为了进一步阐明余辉发光的机理，我们研究了光辐照对HD-Br化学结构的影响，660激光辐照10 min后，HD-Br在696 nm处的典型吸收峰明显减弱，并且在721 nm处的荧光发射显示出明显的降低。而在460 nm处出现新的荧光发射这些结果暗示HD-Br的缀合结构的破坏，为了确定在660 nm激光照射期间HD-Br的ROS生成，使用电子自旋共振（ESR）光谱法来指示1O2，使用2，2，6，在TEMP和HD-Br的存在下，在660 nm激光照射下，TEMP/1O2加合物（1：1：1）的典型共振峰为100 nm。观察到1），证实了HD-Br的1O2的产生。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和质谱分析，对HD-Br在光照后的反应产物进行了探索，FTIR光谱中在1639 cm−1处检测到氧化HD-Br片段的明显羰基特征峰，这证实了HD-Br氧化成各种芳族羰基化合物然后，通过质谱法表征光照射后HD-Br的反应产物。结果表明HD-Br可以与多个1O2分子反应生成多种氧化加成产物（内过氧化物，EPO），包括EPO-2 O、EPO-3 O、EPO4 O、EPO-5 O、EPO-6 O，其中EPO-2 O是主要中间体（IM）。用硅胶柱层析法对HD-Br光辐射后的最终产物1O_2和1Br进行了纯化，并对这些最终产物的化学结构进行了表征根据其质谱和1H NMR谱确认了（IM 2-1、IM 2-2、IM 4-1和IM 4-2。根据主要中间体（EPO-2 O）和主要最终产品（IM 2-1，IM 2-2，IM 4-1和IM 4-2），根据它们的产量，我们推测HD-Br与1O2的氧化加成反应生成EPO2O可能是主要的光化学途径，并且我们对最终产物进行了较长时间的辐照（0.5 h）。
用于分子成像的刺激响应余辉探针的“四合一”设计
根据上述研究，我们证明了HD-Br产生荧光（S1至S 0）和1O2（S1至T1）的能力。受HD-Br余辉产生机制的启发，我们推测酚羟基也可以作为余辉的调节位点，因为它可以作为同时控制荧光和1O2的调节位点。由于HD-Br中羟基的质子化/去质子化可以改变分子内电荷转移（ICT），我们首先研究了pH对HD-Br的荧光和余辉的影响。HD-Br的荧光和余辉发射随着pH的增加而增强。结合pH依赖的吸收和荧光光谱，我们证实HDBr本身可以作为pH传感的分子余辉探针（MAP-pH）。39此外，在包括金属离子、活性硫化物物种（RSS）和活性氧物种（ROS）的各种物种中孵育后，MAP-pH的余辉增强（AF/AF 0）没有显示出明显的变化，这表明对这些干扰具有良好的耐受性。在HD-Br的基础上，我们进一步设计了另外两种分子余辉探针通过在HD-Br的酚羟基上引入响应单元，设计了一种新的荧光探针（MAP-O2·−和MAP-NH 4），用于检测O2·−和亮氨酸氨肽酶（Leucine aminopeptidase，NH 4）。合成过程如方案S1所示。由于取代基抑制了芳香羟基的供电子能力，MAP-O2 ·-和MAP-O2·-在初始状态下表现出相似的光学性质，最大吸收在λ 600 nm处，几乎没有荧光。接下来，我们研究了这些探针对不同靶点的光学响应。从吸收光谱来看，MAP-O2·−和MAP-O2·−的最大吸收分别在O2·−或O2·−处理后从600 nm移至696 nm。在荧光光谱中，在721 nm处的荧光发射显著增加，表明MAP-O2 ·-和MAP-O2分别对O2 ·-或O2·-具有良好的响应。
MAP的体内高对比度余辉成像
为了显示这些设计的MAPs在活体成像应用方面优于传统荧光探针，我们比较了MAPs在余辉和荧光成像模式下活化前后的成像对比度，探针在pH = 5.4缓冲溶液中（“OFF”状态）或pH = 7.4的缓冲溶液（“ON”状态）皮下注射到小鼠背部，然后，获取余辉和荧光图像。在荧光成像中，我们发现由于强的背景荧光干扰，很难区分“OFF”状态下的MAP-pH和“ON”状态下的MAP-pH，而在余辉成像中，余辉图像显示“ON”状态下的MAP-pH与“OFF”状态下的MAP-pH之间存在显著差异，我们从荧光和余辉图像的标记区域定量发光强度，并进一步计算信号背景比（SBR）和“关断”状态之间的信号增强（INO/IOFF）。我们发现余辉成像显示更高的增强（AFON/AFF和FLON/ FLOFF）和SBR的荧光比。此外，皮下注射MAP-pH显示余辉发光强度在光停止后逐渐降低，余辉信号的半衰期经计算约为60 s。我们研究了MAPO 2·−和MAP-O2·−在体内的成像对比度。（“OFF”状态）或200 μM O2·−（“ON”状态）皮下注射到小鼠背部对于MAP-PCR，将探针在含有0 U/L DNA的缓冲溶液中，（“OFF”状态）或150 U/L（“ON”状态）分别皮下注射到小鼠背部。MAP-O2·-和MAP-O2·-在余辉图像中显示出区分处于“OFF”状态的探针和处于“ON”状态的探针的更高对比度能力，定量结果表明，余辉增强（AFON/AFOFF）的MAP-O2·−和MAP-O2·−也高于相应的荧光增强（FLON/FLOFF）。然后测定与O2 ·-或O2·-孵育的MAP的定量SBR，结果显示余辉具有比荧光更高的SBR。此外，与荧光相比，余辉还显示出SBR在“OFF”和“ON”状态之间的较大差异。
我们证明了半菁分子的余辉发光，阐明了HD-Br的余辉发光机理，HD-Br分子在光照射后首先将光能传递给氧，产生1O2，然后，1O2攻击HD-Br形成内过氧化物中间体，其将分解成相应的醛或酮并释放化学能以激发发射体用于余辉成像。重要的是，通过在HD-Br的羟基上引入不同的响应单元，定制了三种可激活的分子余辉探针，用于pH、O2·−或氨肽酶的超灵敏成像。由于“四合一”的设计，刺激响应单元可以同时控制荧光的引发和1个O2的产生，所以这些探测器的余辉增强荧光成像（从OFF到ON）的灵敏度显著提高，并且高于荧光成像，导致放大的成像灵敏度和用于体内余辉成像的SBR。我们的工作引入了一种新的分子支架，用于设计各种可激活的分子余辉探针，用于活体动物的分子成像。
参考文献
“Four-In-One” Design of a Hemicyanine-Based Modular Scaffold for High-Contrast Activatable Molecular Afterglow Imaging,Yongchao Liu, Lili Teng, Xiao-Feng Lou, Xiao-Bing Zhang,* and Guosheng Song,J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 5134−5144,https://doi.org/10.1021/jacs.2c11466
