内容提要
由于颅骨强光衰减和高背景干扰，脑胶质瘤边缘的确认仍然是精确成像和靶向治疗的挑战。近红外二区(NIRII)光声成像(PAI)具有较深的穿透性和较高的灵敏度，在脑胶质瘤成像中具有很大的潜力。本文合成了包裹克酮酸染料A1094的多肽RGD修饰的乙型肝炎病毒核心蛋白(A1094@RGD-HBc)，利用A1094的聚集诱导吸收增强机制（AIAE）用于脑胶质瘤的NIRII PAI。A1094@RGD-HBc具有增强的近红外二区吸收，在体内实现了9倍的PA信号放大，脑胶质瘤的PAI深度可达5.9mm，同时，131I标记的A1094@RGD-HBc可以精确共定位获得高分辨率PAI和超灵敏的脑胶质瘤单光子发射断层图像（SPECT），展示其在脑胶质瘤的诊断成像和精确治疗的临床应用上的巨大前景。
结果与讨论
A1094的HOMO和LUMO轨道能量分别为−4.47和−3.57 eV，近红外吸收的能带隙很小。A1094在1094 nm处有很强的吸收峰，在乙醇、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中溶解良好。A1094在不同pH下表现出不同的吸收水平。A1094在酸性pH值(4.1-5.9)中具有较强的吸收能力，这表明A1094适合作为探针用于肿瘤酸性微环境成像。在白光或激光照射下，A1094在二氯甲烷中是稳定的。即使浓度低至62.5 µg mL−1DMSO溶液中，A1094的PA性质也表现出较高的检测灵敏度。将A1094被封装到RGD-HBc蛋白中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析证实了RGD-HBc的活性。动态光散射和透射电镜均显示A1094@RGD-HBc的直径在30 nm左右。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及在980 nm激光照射下(0.5 W cm−2,10 min)， A1094@RGD-HBc的优良光热稳定性。将A1094加载到RGD-HBc蛋白后，在NIR II区明显出现AIAE。即使在很低的浓度(25 µg mL−1)下，A1094@RGD-HBc也具有很强的吸收强度，且呈非线性关系。为了进一步说明AIAE的作用机制，我们将A1094@RGD-HBc用DMSO解离，使RGD-HBc蛋白释放出A1094，从而导致NIR II吸收减少而在Oil Red O@RGD-HBc中，未发现AIAE效应。为了研究RGD对人原发性胶质母细胞瘤细胞系(U87MG)的选择性，U87MG细胞分别与RGD-HBc、HBc和PBS孵育。RGD-HBc孵育12 h后，细胞的荧光强度比PBS处理的细胞亮9.6倍，比HBc处理的细胞亮1.6倍。共聚焦显微镜结果显示A1094@RGD-HBc比A1094@HBc更特异的细胞摄取。
在A1094@RGD-HBc的NIR II区高效的靶向性和高增强的吸收，促使我们进一步探索其在不同波长的吸收。1200-1300 nm处聚集体的PA振幅明显强于800-950 nm处，说明AIAE的性能。具有AIAE特性的1200 nm处显著的PA振幅。PA信号在解聚状态下表现出微弱的PA信号，表明增强的PA振幅是由A1094聚集引起的。将A1094@RGD-HBc皮下注射到小鼠皮肤中。在1200 nm左右的激发下检测到优良的PA信号，无AIAE特性的对比在体内表现出较低的PA信号。RGD-HBc中A1094的聚集可在体内实现9倍吸收增强，表明其作为深部脑肿瘤PAI具有明显优势。考虑到在小鼠颅骨中已被证明在1064 nm处相对较弱的光衰减，选择1064 nm进行体内原位脑胶质瘤的PAI。
利用自制的声分辨光声显微镜(AR-PAM)，经过低剂量A1094@RGD-HBc(100µg×mL−1)静脉注射，PA模型监测A1094@ RGD-HBc的积累，超声(US)模型显示肿瘤位置。PA和US的b级扫描显示，肿瘤来自脑皮肤的深度为5.9 mm 。由于AIAE的性质，A1094@RGD-HBc的剂量仅为ICG@RGD-HBc的四分之一。
注射后2 h后，伪彩色显示肿瘤在1064 nm处增强的PA信号，而灰色显示颅骨的共定位图像，A1094@RGD-HBc作为一种有效的脑肿瘤PA成像剂。经过131I标记的 131I-A1094@RGD-HBc SPECT/CT图像显示，注射后2小时肿瘤放射性摄取增强，这与PAI结果一致。成像后，脑组织用于放射自显影研究，并收集主要器官进行H&E染色。与正常脑片相比，肿瘤脑片具有较高的放射性摄取，具有良好的特异性。结果表明，131I-A1094@RGD-HBc具有极高的效率、特异性和生物相容性，可作为原位深部脑胶质瘤PAI和超灵敏SPECT成像的理想造影剂。
结论
本究利用AIAE机制，克服传统发色团聚集猝灭效应而对成像的不利影响，实现在NIR II窗口对脑深部肿瘤PAI的作用。A1094@RGD-HBc在有限的空间封装成蛋白载体后，表现出增强的NIR II吸收和强大的PA造影增强能力，在原位脑深部肿瘤成像中具有广阔的应用前景。利用AIAE效应这种光吸收过程来构建合适的吸收聚集体，表现出优异的光稳定性、特异性肿瘤靶向性和高效的浓度依赖性吸收，可以将其深度PAI的优势延伸到临床转化。
参考文献
Aggregation-Induced Absorption Enhancement forDeep Near-Infrared II Photoacoustic Imaging of Brain Gliomas In Vivo. Yajing Liu, Huanhuan Liu, Huixiang Yan,Yingchao Liu, Jinsen Zhang, Wenjun Shan, Puxiang Lai, Honghui Li, Lei Ren,Zijing Li,* and Liming Nie*. Adv. Sci. 2019, 6, 1801615. DOI: 10.1002/advs.201801615.
