内容提要
准确诊断对于脑肿瘤患者的最佳治疗结果具有重要意义。由于NIR-II荧光成像具有深穿透和高灵敏度，开发高量子产量(QY)的有机NIR-II荧光探针，在脑肿瘤诊断方面前景广阔。本文报道了一种具有聚集诱导发光(AIE)特性的NIR-II荧光分子用于原位脑肿瘤成像。该分子包埋在聚合物基体中，QY为6.2%，740 nm处的吸光率为10.2 L g−1 cm−1，最大发射波长接近1000 nm。AIE纳米粒子经过c-RGD修饰，获得靶向AIE纳米粒子，具有特异性和选择性的肿瘤摄取，高信号/背景比为4.4，分辨率高达38 µm。而且，AIE纳米粒子具有较大的近红外吸收率，有利于NIR-I光声成像，其穿透深度比NIR-II荧光成像更深，可以通过完整的头皮和颅骨精确检测肿瘤深度。本研究展示NIR-II AIE纳米自粒子在NIR-II荧光和NIR-I光声成像中用于脑癌精确诊断的前景。
结果与讨论
苯并二噻唑(BBT)是一种强缺电子受体，构成小分子和共轭聚合物具有近红外吸收和近红外-II发射。N,N -二苯基-4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯胺(DPTPEA)分子具有较长的共轭长度和高的给电子性能，将其键接在BBT受体上，合成的TB1由于具有较强的D-A强度和扩展的电子共轭具有较大的消光系数和NIR-II发射。四氢呋喃中的TB1在352和710 nm处有两个吸收峰，发射峰在981 nm处，发射尾在NIR-II窗口延伸超过1000 nm，表明TB1是一个NIR-II发射器。为了研究TB1的AIE性质，PL光谱用于监测TB1在THF/水混合物中随水体积分数(fw)的变化的荧光波动。随着fw从0逐渐增加到40%，TB1的荧光明显猝灭，发射峰从980 nm向992 nm倾斜，这是由于TB1分子扭曲的分子内电荷转移所致。从40增加到90%，TB1的PL强度急剧增加，表现出AIE特征，发射峰从992 nm移动到975 nm。固态TB1比其在二甲基亚砜(DMSO)中的可溶性状态更亮，而传统的NIR-II染料IR-26在固态中表现出湮灭的NIR-II荧光，说明TB1作为NIR-II发射AIE分子的独特性。通过密度泛函理论计算，TB1倾向于沿主干形成强烈扭曲构象，导致AIE特征。中心BBT平面(P1)与其相邻的苯环(P2)之间的扭转角约为36°，而芳胺的任何两个苯环之间的二面角都在67°以上。HOMO波函数在BBT和DPTPEA单元之间都很好地离域，而LUMO波函数更多地分布在缺电子的BBT受体上，表明在TB1主干内有效的分子内电荷转移导致了长波长吸收。
通过磷脂DSPE-PEG2000包裹形成TB1纳米粒子，为了赋予TB1肿瘤特异性靶向作用，多肽(c-RGD)通过Michael加成反应形成TB1-RGD纳米粒子，该多肽能有效靶向肿瘤血管中过表达的αVβ3整合素受体。TB1-RGD纳米粒子显示球形形貌与尺寸约36和41 nm，通过激光透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS) 。TB1纳米粒子在740 nm附近有很强的吸收最大值。在740 nm波长下，TB1纳米粒子的消光系数为10.2 L g−1 cm−1，在NIR-I PA成像中也有很好的应用前景。TB1纳米粒子以975 nm为中心的荧光峰和一个延伸到NIR-II区域的大尾巴。以IR-26染料作为参比，在808 nm激发下，TB1点的NIR-II QY为6.2%，显示出非常高的NIR-II荧光灵敏度。TB1纳米粒子(0.1 mg mL−1)的NIR-II荧光在808 nm照射下(45 mW cm−2)鸡肉组织下的穿透深度高达3 mm。TB1纳米粒子的PA光谱与紫外-可见光谱一致。通过体外模拟实验，740 nm处的PA强度与点浓度呈线性关系，揭示了通过PA强度可以确定活组织中点浓度PA信号在740 nm脉冲激光照射下对TB1纳米粒子的检测限为62.5 µg mL−1，表明PA具有良好的灵敏度。可以发现PA信号的检测浓度限值比NIR-II荧光高15倍，说明PA信号对TB1点的敏感性低于NIR-II荧光信号。TB1纳米粒子也表现出很好的PA稳定性，即使经过4000次脉冲激光照射强度也没有变化。在740 nm (15 mJ)脉冲激光照射下，鸡肉组织下的TB1纳米粒子(0.1 mg mL−1)可清晰显示，最高可达6.5 mm，比NIR-II荧光成像的穿透深度深两倍以上。穿透深度的差异是由于在生物组织中，超声用于PA图像重建的衰减远低于用于NIR-II荧光成像重建的衰减发射光。因此，TB1纳米粒子的潜在的NIR-II荧光和NIR-I PA双模态成像可以利用各自的优点，实现较高的成像效果。为了研究c-RGD修饰纳米粒子的靶向作用，采用808 nm激励下的NIR-II荧光显微镜研究细胞摄取。孵育时间选择30分钟，以最大限度地提高靶向作用和最小化非特异性细胞摄取。靶向TB1-RGD纳米粒子孵育的细胞显示出比TB1纳米粒子处理的细胞高4.5倍的荧光信号，这表明c-RGD修饰有助于增强肿瘤摄取。采用体外标准CCK-8检测TB1-RGD点的细胞毒性，均保持在90%以上。TB1-RGD纳米粒子具有非优良的生物相容性，有望用于体内成像研究。
为了评估体内TB1纳米粒子的NIR-II荧光成像性能，首先对健康裸鼠进行淋巴系统成像。注射后2分钟，连接TB1纳米粒子注射部位和前哨淋巴结的淋巴血管清晰可见。沿红虚线清晰可见的淋巴管分辨率为115 µm，S/B为3.2，通过NIR-II荧光成像可以快速准确地定位淋巴系统。进一步利用AIE纳米粒子通过完整的小鼠头皮和颅骨定位脑血管和脑肿瘤结构。当肿瘤直径达到2–3 mm时，将相同数量的TB1和TB1-RGD纳米粒子(0.5 mg kg−1)分别注射到不同的小鼠体内。在成像过程中，脉冲/连续的近红外激光穿过小鼠头皮和其致密的颅骨到达肿瘤，AIE纳米粒子的NIR-II发射和声波分别通过激子的辐射和非辐射衰减路径局部产生。在系统给药AIE纳米粒子之前，没有观察到明显的荧光信号，说明在我们的实验条件下，可以忽略组织自身荧光。注射(0.5 mg kg−1)后，立即清晰地显示了38µm的脑血管结构，表明NIR-II荧光成像具有良好的时空分辨率。在体内循环时，随着时间的推移，点在肿瘤、肝脏等主要器官中逐渐积累，血管中的点浓度也随着时间的推移逐渐降低。特别是，在注射后的每个时间点，TB1-RGD纳米粒子的小鼠比TB1纳米粒子处理的小鼠表现出更强的肿瘤荧光。在研究的0-24 h内，肿瘤内的NIR-II荧光强度达到最大值，TB1-RGD纳米粒子组肿瘤对正常组织的(S/B)NIR-II为4.4，而TB1纳米粒子组的(S/B)NIR-II仅为2.2。这些结果表明，不仅纳米粒子成功地通过血脑屏障，而且c-RGD修饰有助于增加细胞的摄取和特异性。，体外生物分布研究表明，斑点主要分布在肝脏、脾脏和肿瘤。注射TB1纳米粒子的小鼠主要器官的荧光强度普遍高于注射TB1纳米粒子的小鼠。
TB1和TB1-RGD纳米粒子处理小鼠的PA成像结果。超声勾画脑边界，PA信号监测脑肿瘤纳米粒子造影剂积聚情况。给药前，从颅骨和头皮观察到可检测到的PA信号，表明头皮的氧血红蛋白和脱氧血红蛋白在NIR-I区域有一定的吸收能力。纳米粒子注射(0.5 mg kg−1)后，脑肿瘤中PA信号随时间推移逐渐增加，TB1-RGD纳米粒子注射组在注射后各时间点脑组织PA强度均明显高于TB1纳米粒子注射组。在0-24 h的时间范围内，TB1纳米粒子组的PA信号在注射后24 h达到最大值，肿瘤区域深度没有很清楚的描绘。TB1-RGD组在注射后24 h，肿瘤PA信号达到最大值，肿瘤深度为2.0 mm的区域清晰成像。这说明c-RGD修饰有助于提高局部浓度，从而大大提高成像信号和深度。PA成像可以有效地通过完整的头皮和颅骨提供精确的肿瘤深度信息，这是普通的NIR-II荧光成像难以实现的。
结论
作者首次报道具有双荧光和光声成像的NIR-IAIE分子，通过磷脂包裹的AIE纳米粒子具有达6.2%的NIR-II荧光量子产率，并成功应用于双NIR-II荧光和NIR-I光声成像，用于精确的无创脑肿瘤诊断。实验显示NIR-II荧光成像显示38µm的高分辨率脑血管结构，检测限为3.9µg mL−1。同时，NIR-I PA成像在本质上比NIR-II荧光成像具有更高的穿透深度，可以清晰地描绘脑内肿瘤的深度。靶向c-RGD修饰的AIE纳米粒子协同双峰成像对脑肿瘤诊断具有良好的特异性和高灵敏度，S/B值为4.4，能准确评估脑组织内肿瘤的位置深度。本研究为脑血管和脑组织异常的监测和可视化提供了巨大的潜力来精确诊断脑肿瘤。
参考文献
Bright Aggregation-Induced-Emission Dots for Targeted Synergetic NIR-II Fluorescence and NIR-I Photoacoustic Imaging of Orthotopic Brain Tumors. Zonghai Sheng, Bing Guo, Dehong Hu, Shidang Xu, Wenbo Wu, Weng Heng Liew, Kui Yao, Jingying Jiang, Chengbo Liu, Hairong Zheng,* and Bin Liu*. Adv. Mater. 2018, 1800766, DOI: 10.1002/adma.201800766
