内容提要
光声成像技术是生物医学研究中一种重要的无创成像技术。小分子秒近红外窗（NIR-II）PA染料结合成像数据可以提供全面和深入的体内生理和病理信息。然而，NIR-II PA染料由于缺乏一个容易光学调谐的基团，通常表现出“永远在线”的特性，这阻碍了其在体内的进一步应用。本文中，已经设计并合成了一类新型染料GX作为可活化的NIR-II PA平台，其中GX-5的吸收/发射波长延伸至1082/1360 nm。重要的是，GX染料在NIRII PA 3D成像中对小鼠血管结构具有强的组织穿透深度和高分辨率，并且在NIRII荧光（FL）成像中具有高信噪比。此外，为了证明GX染料的适用性，第一个NIR-II PA探针GX-5-CO活化一氧化碳（CO）的工程和高对比度NIR-II PA和FL成像揭示高血压小鼠的CO水平的增强。我们期望GX染料的许多衍生物将被开发以提供多功能的NIR-II PA平台，用于设计各种各样的可活化的NIR-II PA探针作为生物医学工具。
结果与讨论
传统的NIR-II PA染料包括供体-受体-供体（D-A-D）和聚亚甲基（D-π-A）荧光团，两者都具有长共轭结构。然而，这些染料通常缺乏光学可调基团，阻止它们成为用于复杂生物体中的特定生物标志物的PA成像的期望的NIRII PA染料。罗丹明染料及其酰胺衍生物具有独特的光学开关特性，被广泛应用于体内特异性荧光成像支架。然而，常规的罗丹明染料通常限于可见光区域中的吸收和发射。以前的工作表明，通过Fischer醛延伸罗丹明的共轭结构导致吸收和发射的显着红移。因此，通过扩展共轭结构使罗丹明衍生物的吸收和发射波长发生红移是可行的。然而，Fischer醛延伸到罗丹明衍生物仅使吸收和发射波长红移到近红外线。作者证实，将具有较长共轭结构的咕吨端基X1-5引入罗丹明骨架中可能会使罗丹明衍生物的波长进一步红移。为此，我们首先比较了咕吨衍生物X-1与Fisher醛的吸收和发射波长，发现X-1相对于Fisher醛分别红移了60/81 nm。另一方面，最简单的罗丹明荧光团罗丹明110具有497/520 nm的最大吸收和发射，但罗丹明B显示λAbs /λem=548/572 nm，这表明通过端基修饰罗丹明衍生物可能引起吸收/发射波长的红移。富电子氧杂蒽衍生物的引入可以进一步增强其推拉电子系统，从而进一步扩展罗丹明衍生物的吸收和发射波长。
为了预测X1-5可能的性质，使用Gaussian 16程序优化和分析X1-5和Fischer醛的结构，并同时使用Multiwfn和VMD程序进一步处理。DFT计算表明，正电势从X-1到X-5增加，并且X-5的推拉电子效应最强，表明X-5增强了分子内电荷转移（ICT）。有趣的是，比较Fisher醛、X-1和X-5的能量轨道，我们可以发现X-5的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）能级增加，HOMO的增强比LUMO能级的增强更快，导致带隙变窄。含时密度泛函（TDDFT）计算表明，X-5的吸收波长相对于Fisher醛红移了128 nm。基于这种比较，一方面，可能是氧杂蒽衍生物具有比费歇尔醛更长的共轭结构，这导致了波长的红移。为了进一步证实上述结果，我们合成了化合物X-1、X-2、X-3、X-4和X-5，其中X-5具有最长的吸收波长。另一方面，在氧杂蒽衍生物骨架中引入更多的富电子氮杂环可以进一步减小HOMO/LUMO能隙，延长吸收和发射波长。此外，罗丹明骨架结构GC是明显的吸电子结构。GC部分的优点是能够发出信号开启和关闭。当咕吨供体片段与GC部分组合以形成光声染料时，这些染料将具有“可活化”性质。同时，与闭合状态下的GC相比，开环化合物GC具有更高的ESP值和更均匀的正负电位分布，产生更强的推挽电子效应，促进电荷转移的发生。有趣的是，二乙胺端基具有很强的供电子能力。化合物GC的二乙基氨基部分HOMO上的电子密度充分离域到氧杂环核。因此，富电子的二乙基氨基部分的存在可以显著降低氧化电位，增强分子内电荷转移的能力，并促进波长的进一步红移。基于这些考虑，我们设计了一系列具有不同取代基的NIR-II PA染料GX 1 -5。我们预期GX 1 -5可能具有不同的吸收和发射波长。
为了评价近红外PA GX染料设计策略的可行性，我们用密度泛函理论研究了GX 1 -5的HOMO和LUMO能级。GX-1 ~ GX-5的HOMO能级和LUMO能级以HOMO能级（-5.06eV→4.71 eV）比LUMO能级（-2.95 eV→2.80 eV），最终导致带隙从2.11到1.91 eV，逐渐变窄。此外，GX-1至GX-5的正电位不断增加，这可能增强ICT的驱动力，并促进波长的进一步红移。在相同的计算条件下，罗丹明B在可见光区的能隙和近红外-I罗丹明染料CS的能隙分别为2.79和2.33 eV。这种缩小的能隙将GX染料的波长推过可见光区和NIR-I进入NIR-II。同样，增加的偶极矩也给出了类似的假设。罗丹明B和CS的偶极矩分别为5.17和6.57，而GX-5的偶极矩增加到10.03，显示分子内电荷转移的持续增强，表明吸收和发射波长可能向NIR -II红移。通过密度泛函理论计算优化了罗丹明B和GX 1 -5的结构，为进一步的理论研究奠定了基础。GX 1 -5的苯甲酸部分高度扭曲，基本上垂直于氧杂蒽平面，二面角为102.2°、99.0°、-98.7 °、107.1°、106.8°，与罗丹明B的105.9°相似。GX 1 -5中苯甲酸和氧杂蒽部分的C-C键长（C9-C31）分别为149.1、149.2、149.0、149.1 μ m（表S1-S6），与罗丹明B的C-C键长（C9-C17）相似（148.7 μ m），表明GX 1 -5与经典的罗丹明B相似，因为它们的苯甲酸部分和咕吨核心基本上是未缀合的。此外，GX 1 -5的两个氧杂蒽部分在一定程度上是共轭的，主链的所有C-C键长约为140.0 pm。这个值是典型的C-C单键（154 pm）和双键（134.0 pm）之间的中间值，与罗丹明B骨架的C-C键长相当。综合以上结果，GX染料可能是一种较好的可活化近红外-Ⅱ罗丹明染料衍生物。
为了获得基于罗丹明的NIR-II PA染料，合成GX 1 -5 PA染料。通过1H NMR、13C NMR和HRMS（高分辨率质谱）对GX 1-5的结构进行了充分表征。我们研究了GX染料在不同溶剂中的化学物理性质。其中，GX 1 -5在1，2-二氯乙烷（DCE）中的荧光量子产率分别为0.143%、0.177%、0.901%、1.150%和1.003%（表S7-S9）。GX 1 -5在H2O中的最大吸收/发射波长分别为691/924 nm、736/928 nm、889/1035 nm、896/1048 nm和905/1066 nm。值得注意的是，GX-5在H2O中的吸收/发射波长可以扩展到1082/1360 nm。这可能是溶剂效应的结果。染料GX在H2O体系中的显着性能表明，这类新的NIR-Ⅱ PA染料在生物体系中具有广阔的应用前景。与之前构建的NIR-I罗丹明衍生物CS相比，GX-5的最大吸收波长红移超过200 nm。上述结果表明，GX具有近红外-Ⅱ类染料的吸收和发射。值得注意的是，为了验证GX染料的上级光稳定性，使用临床批准的ICG作为参考，用CW激光照射GX 1 -5的溶液。60分钟后，ICG的吸收强度降低约60%，但GX 1 -5的吸收强度仅降低1- 14%，表明GX染料比ICG更光稳定。此外，我们进一步比较了染料GX 1 -5与ICG在血液中的稳定性，发现染料GX 1 -5的光稳定性仍远优于ICG。为了说明GX染料的潜在生物适用性，我们针对一系列常见的活性氧物质（例如：ONOO-，H2O2，HClO）和生物相关的亲核试剂（例如H2S，GSH和Cys）对其进行了测试，以评估化学稳定性。此外，测试了染料GX 1 -5在生理盐水和FBS中的溶解度，发现GX 1 -5具有良好的溶解性。GX染料具有良好的光稳定性和化学稳定性，进一步证明了其在生物成像应用中的可行性。
为了探索染料GX用于PA成像的潜力，我们首先在HEPES溶液（10 mM，pH 7.4，含有10%DMSO和1%tween-80）中进行PA感测测试。GX 1 -5显示出优异的PA信号，表现出良好的NIR-II FL信号。同时，我们研究了染料GX的PA和FL信号在激光照射3小时内的变化。染料ICG在90分钟后几乎没有信号，而GX 1 -5在3小时时仍显示出良好的PA和FL信号。这些结果表明，染料GX可能是有利的NIR-II PA和FL成像剂在体内应用。
用于生物医学成像的优良NIR-II染料的先决条件是低细胞毒性。染料GX表现出极低的细胞毒性。接下来，我们研究了NIR-II GX染料在体内比NIR-I罗丹明衍生物CS的优势。将GX 1 -5和CS分别注射到活体小鼠体内。其中，在3D PA成像中，CX-5的组织穿透深度可达10 mm，而CS的组织穿透深度仅为5 mm。同时，通过NIR-II 3D PA成像和2D FL成像系统，我们发现GX-5仍然表现出长达6小时的长期生物成像能力，而CS在6小时内几乎没有检测到信号。上述结果表明，染料GX可以应用于多种成像模式，以检测生物体的深部组织，并获得多重信息。相比之下，许多染料（包括近红外染料）在渗透深度和实时成像方面受到限制，导致获取高质量图片和视频的障碍。在本研究中，我们使用GX-5或CS对小鼠全身进行了NIR-II PA和FL成像。GX-5能清晰地分辨小鼠血管。即使在640×512像素的分辨率下，GX-5也可以提供高SNR的NIR-II 2D FL图像。血管在1 - 2 - 3处的半高全宽通过高斯拟合进行拟合，即使直径为0.21 mm的血管也可以区分。更重要的是，GX-5通过高分辨率NIR-II PA成像更全面地显示了小鼠血管的分布。GX 5的3D NIR-II PA成像视频从多个角度获得了小鼠全身血管的分布。此外，血管系统（四个纵向血管）可以通过3D NIR-II PA成像观察到。值得注意的是，3D NIR-II PA的血管分辨率优于2D FL成像。这进一步表明GX-5可能具有出色的NIR-II 3D PA成像和2D FL成像能力。与此形成鲜明对比的是，CS（近红外-I罗丹明衍生物）不能以高分辨率对血管系统成像。这些结果表明，NIR-II罗丹明衍生物染料GX具有更好的实时和高对比度的在体成像能力比近红外-I罗丹明染料。染料GX的优异的NIR-II PA和FL特性可为全身血管的精确外科导航奠定坚实的基础。
羧酸改性染料GX的优异的近红外-Ⅱ PA和FL生物成像性能和有趣的生物物理性能启发我们研究通过其螺环化开发染料GX作为PA或FL探针的可能性。内源性CO参与一系列生理过程，包括抗炎反应、神经传递、血管平滑肌和血管舒张。CO的异常水平可导致严重的疾病，例如呼吸系统疾病、阿尔茨海默病和高血压。然而，可活化的NIR-II探针尚未用于检测CO。在此，我们工程化了第一个NIR-II PA CO活化探针GX-5-CO。
GX-5-CO的合成路线，化合物通过1H NMR、13 C NMR和HRMS表征。探针GX-5-CO与CO可能的反应机理见图。加入CORM-3后，GX-5-CO溶液的最大吸收和发射逐渐增加，并在100 μM时达到饱和点。加入100 μM CORM-3后，最佳吸收值增加了200倍，吸收值与CORM-3浓度呈良好的线性关系，检测限为1.2×10 6 M，表明GX-5-CO对CO响应具有良好的灵敏度。在将CORM-3加入GX-5-CO后进行的时间依赖性研究表明反应是快速的，并在2分钟内达到最大值。在GX-5-CO对生物活性物质的响应中，CORM-3存在时GX-5-CO的吸收值明显增加，而其他物质仅引发微小变化。此外，GX-5-CO在HEPES溶液（10 mM，pH 7.4，10% DMSO和1% tween-80）中对CO仍有良好的响应。因此，这些结果支持GX-5-CO具有进一步体内成像应用的潜力。
为了说明GX-5-CO设计和光学实验的合理性，我们采用DFT理论计算来验证GX-5-CO的物理性质是否受2-（肼基甲基）吡啶部分的控制。GX-5-CO的计算HOMO-LUMO能隙从1.91增加到2.55 eV，表现出吸收和发射的明显蓝移。此外，GX-5中存在明显的推拉电子效应，其产生显著的ICT效应，导致长波长吸收和发射。然而，2-（肼基甲基）-吡啶部分抑制这一过程，表现出较弱的推拉电子系统。类似地，GX-5-CO（μ=2.78）具有较小的偶极矩，表明GX-5-CO分子中正电荷和负电荷的分离不如GX-5（μ=10.03）明显，这也表明GX-5-CO的ICT过程被阻断。此外，比较GX-5-CO和GX-5的结构，我们发现GX-5的芳环（1，2，3，4个原子）的二面角为-0.24 °，远小于GX-5-CO（1，2，3，4个原子）的二面角-14.3 °。GX-5-CO的二面角比GX-5的二面角大，表明不太理想的平面结构不利于分子内电荷转移（ICT）过程。再次证明了2（肼基甲基乙基）-吡啶部分在调节GX-5-CO信号开放中的有效性。加入CORM-3后，2-（肼基甲基）吡啶与CO发生反应，导致五元环开环，形成良好的推拉电子体系，产生较强的吸收和发射。为了探索溶液中GX-5CO的NIR-II PA成像能力，将GX-5-CO与不同浓度的CO孵育。PA信号随着CORM-3浓度的增加而逐渐增加至饱和。GX-5-CO在FL成像中也表现出类似的现象。
为了探索GX-5-CO在生物系统中的适用性，通过MTT法将GX-5-CO与HeLa细胞孵育，观察到低细胞毒性。此外，为了评估探针对体内CO的特异性反应，小鼠皮下注射GX-5-CO和不同浓度的CORM-3。仅用GX-5-CO处理的小鼠表现出微弱的NIR-II PA和FL信号。随着增加剂量的CORM-3的加入，可以观察到PA信号的显著增强。同时，FL成像也获得了类似的结果。上述结果表明，GX-5-CO可用于近红外-ⅡPA/FL成像，实时无创检测体内CO水平的上调。高血压是缺血性心脏病、心力衰竭和血管性痴呆等疾病的主要原因。CO代谢和功能的改变与高血压的发生和维持密切相关。因此，探讨高血压时CO的变化，对于进一步了解高血压的发病机制和病理过程具有重要意义。
为了研究GX-5-CO在高血压小鼠中特异性成像的能力，我们建立了具有血管紧张素II（Ang II）的高血压小鼠模型。氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪是治疗高血压的常用药物。据文献报道，三者联合使用可取得较好的治疗效果。因此，我们进一步用氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪治疗高血压小鼠。采用无创血压测量系统对正常小鼠、高血压小鼠和治疗组小鼠的血压进行了研究。对照组小鼠的舒张压（DBP）和收缩压（SBP）分别为73和96 mmHg，而高血压组小鼠的DBP和SBP分别增加至112和145 mmHg。这表明高血压小鼠模型的成功构建。而且观察到治疗组小鼠的血压与对照组小鼠的血压基本相同，表明用于高血压治疗的小鼠模型构建成功。采用PA/ FL成像技术观察高血压小鼠和正常小鼠不同时间点GX-5-CO信号的变化。对于对照组和治疗组小鼠，在GX-5-CO注射后未获得明显的PA/FL信号。对于高血压小鼠，无论是近红外II型3D PA还是实时FL成像，信号都随着时间的推移逐渐增加，4 h后达到最大值。这些数据为GX-5-CO在高血压小鼠中的视觉检测和治疗提供了进一步的证据。此外，对空白组、高血压组和高血压治疗组小鼠进行成像后，取出上述各组小鼠的心、肝、脾、肺和肾，以探索器官的分布。我们发现只有高血压组的小鼠显示荧光被打开，并且主要集中在肝脏组织中，在其他器官中分布较少。这可能是由于肝脏是体内主要的代谢器官。综上所述，上述结果表明，新的近红外探针GX-5-CO可以成像内源性产生的CO在高血压小鼠。
结论
综上所述，我们提出了一种新的策略来设计和合成一类可活化的NIR-II PA染料GX，其具有通过螺环化的羧酸控制的光学ON-OFF开关机制，其中GX-5的吸收/发射波长延伸至1082/1360 nm。密度泛函理论计算表明，GX具有罗丹明染料的典型结构特征。与可见光区的罗丹明B和近红外I罗丹明CS相比，GX-5具有更小的分子轨道间隙和更大的偶极矩。重要的是，为了进一步证明染料GX的优异光学和PA性质，我们采用GX-5分别通过PA和FL成像在3D和2D中可视化小鼠血管的分布和结构。此外，以GX-5为激活平台，我们进一步构建了第一个用于特异性检测CO的NIR-II探针GX-5-CO，其能够通过高对比度NIR-II PA和FL成像揭示高血压小鼠中CO水平的增强，证明了我们的新GX NIR-II功能性罗丹明染料的价值。我们预计，这项工作不仅可以激励研究人员开发高效的小分子NIR-II平台，用于靶向激活PA探针，而且还将推动NIR-II染料在PA成像中的进一步应用，以实现未来疾病部位的准确成像引导诊断和手术。
参考文献
A Class of Activatable NIR-II Photoacoustic Dyes for High-Contrast Bioimaging, Jiangfeng Li, Jiangyan Wang, Lizhen Xu, Hanwen Chi, Xing Liang, Juyoung Yoon,* and Weiying Lin*，Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202312632. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202312632
