内容提要
硝基还原酶(NTR)广泛研究于细菌和系统，如酵母，锥虫和低氧肿瘤。线粒体的细菌起源促使作者探索NTR活性可能存在于这个细胞器中，并探索其在细胞中的行为。作者通过一种近荧光近红外(NIR)染料探索细胞线粒体中NTR活性。这种线粒体定位的酶活性既可以用于线粒体的选择性近红外成像，也可以通过激活细胞器内的线粒体来靶向线粒体，构建了一种线粒体成像和靶向的新机制。
为了检测一种可用于线粒体成像的线粒体NTR，作者设计了一种由NTR触发的正电荷荧光探针QCy7。由于在近红外荧光发射可以减少背景和增强光穿透，提供了细胞成像效率。吲哚的存在允许通过简单的吲哚烷基化引入正电荷，邻位、间位和对位取代4-硝基苄氧基-间苯二甲醛的制备提供了合成受保护的QCy7染料所需的烷基化前体。通过线粒体NTR介导的连续还原，然后消除，从非荧光前体发射荧光。为了评估这些探针在检测NTR活性方面的可行性，首先使用纯化的大肠杆菌NTR在无细胞系统中验证了探针。探针2a−2c (10 μM)在含有0.5 mM NADH的pH 7.4 PBS缓冲液中孵育，加入NTR (1 μg/mL)，观察荧光在短时间内的变化。探针2b(间取代)没有观察到荧光增加。使用更大浓度(5 μg/mL)的NTR也没有产生任何可检测到的2b激活。对邻位取代和对位取代的2a和2c可以发生良好的活化，这可以用Li等人最近报道的NTR酶活性位点中对硝基苯化合物更好的结合来解释探针的选择性。只有NTR+ NADH存在时才会显著激活，从而证实了该酶对NADH的依赖性。监测2c的NTR激活过程中的吸光谱图显示以572nm为中心的吸光谱带逐步增加。
作者用A549癌细胞进行了显微镜实验。10 μM 2c与细胞孵育4 h后，加入100 nM的MitoTracker Green (孵育40分钟)，显示2c释放的红色荧光信号 ，绿色通道显示MitoTracker green显示的线粒体。a−c的叠加图显示红色和绿色信号完全重叠，导致核周围出现黄色信号(DAPI染色为蓝色)。作者也测试了探针2a，2b，孵育4 h后没有明显的荧光信号。2b在体外实验中证实没有发生消除过程。2a主要是还原的低动力学所导致。2c信号的出现呈浓度依赖性，在较短的孵育时间后减弱，并被细菌NTR抑制剂双香豆素18所抑制，首次直接显示了线粒体内NTR活性。值得注意的是，不需要缺氧条件，即观察到的活动必须是I型，但这并不排除线粒体中可能存在一个或多个II型NTRs。该探针在常氧条件下对线粒体NTR的选择性可以准确地进行线粒体成像。与利用正电荷和线粒体膜的极化在线粒体中积累的MitoTracker Green成像剂相比，该近红外荧光探针可以利用线粒体内NTR转化为荧光团进行荧光成像。
NTR活性与人类细胞线粒体相关的发现促使作者设计一种基于线粒体毒素抗霉素A(AMA)的前药。AMA只有在相对较高的浓度下才有毒性，这可能是由于缺乏接近线粒体的便利途径。研究表明，至少有一个AMA的作用位点不涉及呼吸链。通过将AMA与对硝基苯基进行o烷基化，促进线粒体传递，并仅在线粒体中释放化合物的活性形式。因此，将AMA烷基化，得到了产率较高的o-p-硝基苄基-AMA(4a)。还制备了苯- AMA(4b)作为阴性对照。化合物4a和4b没有荧光，而AMA荧光。因此，可以监测4a中硝基部分酶还原后线粒体内AMA的释放，但在4b时释放不明显，其外观定位于线粒体。相比之下，经过AMA处理的A549细胞的AMA分布并没有与线粒体完全共定位。
通过比较4a和4b对线粒体呼吸链活性和细胞活力的影响来评估4a和4b。AMA是NADH氧化酶的强效抑制剂，能够检测线粒体呼吸复合物I、III和IV的活性。在50 nM浓度下，AMA对NADH氧化酶的抑制作用基本完全，而4a和4b的活性则弱得多。尽管它们对NADH氧化酶的抑制活性相似，但4a对A549癌细胞的细胞毒性比4b大得多，这无疑是由于NTR使4a在线粒体内与AMA发生转换。化合物4a比外源添加的AMA具有更强的细胞毒性，尽管细胞可以有效内吞AMA，但是并不能有效地传递到线粒体，这是首次实现线粒体NTR选择性递送线粒体药物。为了探索上述生物学现象的普遍性，作者还研究了AMA、4a和4b对其他三种人类细胞系的细胞毒性效应。这些化合物对这些细胞系的影响与培养的A549肺癌细胞观察到的效果非常相似。
结论
作者确定了一种硝基还原酶在人类肺腺癌A549细胞的线粒体的证明,可以用于选择性线粒体释放荧光QCy7，并进入线粒体前体。同样的保护策略被用来制备线粒体毒物抗霉素A的前药。前药比AMA本身更有效地进入线粒体，导致更强的细胞杀伤。与AMA和前药4b相比，AMA前药4a在另外三种人类细胞系中表现出相同的细胞毒性作用。
参考文献
Mitochondrial Nitroreductase Activity Enables Selective Imaging and Therapeutic Targeting. Arnaud Chevalier, Yanmin Zhang, Omar M. Khdour, Justin B. Kaye, and Sidney M. Hecht*. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 12009−12012. DOI: 10.1021/jacs.6b06229
