内容提要
近年来，社会压力的增加和其他因素导致抑郁症患者人数的激增。目前，普遍认为严重抑郁症的内因是脑组织去甲肾上腺素(NE)水平降低。去甲肾上腺素与另外两种儿茶酚胺神经递质——肾上腺素(EP)和多巴胺(DA)在结构和化学性质上非常相似。这三种神经递质在生物系统中通过酶反应依次合成。因此，设计去甲肾上腺素特异性荧光探针具有一定的挑战性。作者采用了“保护-去保护”策略：长发射波长含水溶性磺酸的花菁被硫代碳酯保护，去甲肾上腺素β-羟基乙基胺通过亲核取代和分子内亲核环化反应释放荧光团。该策略实现了去甲肾上腺素的特异性红色荧光检测，以及钾离子刺激下去甲肾上腺素神经信号转导的成像。更重要的是，作者首次实现抗抑郁药物刺激大鼠大脑去甲肾上腺素水平的实时荧光成像。
结果与讨论
作者在体外研究了探针对去甲肾上腺素的紫外-可见和荧光响应。将5mM NE加入含10μM探针的2mL PB (pH 5.0)中。体系在675和775nm处的紫外吸收随时间逐渐减小，而在550nm处的紫外吸收则逐渐增加。因此，在加入NE后，体系的荧光强度在640nm处逐渐增加，是只含探针的体系的14倍。反应后体系的光谱性质与花菁酮本身的光谱性质基本一致。与去甲肾上腺素相比，多巴胺和肾上腺素仍能诱导较少的荧光强度增强。作者还研究了其他神经递质(5mM)，如5-HT，GABA和氨基酸(500μM)，如苏氨酸，丝氨酸，赖氨酸，都没有引起探针明显的荧光变化。另外，100μM半胱氨酸/10μM同型半胱氨酸与类似的巯基乙胺和5mM GSH，也没有诱导显著的荧光响应。本工作大大缩短了探针响应时间，在50min内完成反应，最大限度地减少了氧化还原对去甲肾上腺素的损失。通过质谱证实了探针对去甲肾上腺素的特异性响应机制。
作者选择了几种细胞来标记内源性去甲肾上腺素。当20 μM探针与HeLa细胞和HepG-2细胞在37°C下培养40 min时，未观察到明显的荧光发射。PC12细胞可分泌富含去甲肾上腺素的囊泡并有胞吐作用。与PC12细胞在类似条件下培养后，可以观察到明显的红色荧光发射，并随时间的推移而增加。该探针可以标记囊泡中的去甲肾上腺素去甲肾上腺素排出过程的显像。
高浓度钾刺激细胞产生的动作电位导致电压依赖性钙离子通道去极化，打开钙离子通道。在电化学电位的驱动下，钙离子从外部流入细胞，细胞质中钙离子浓度的增加触发了囊泡与细胞质膜的融合，可以刺激神经递质的释放。作者用高K+溶液刺激孵育探针标记的去甲肾上腺素囊泡的PC12细胞，细胞内的荧光点强度逐渐降低。但在相同条件下，用PBS(不含钾离子)刺激细胞，红色通道的荧光强度几乎没有变化表明，K+浓度增加导致细胞胞饮，探针实现了去甲肾上腺素信号通路的可视化。
作为一种长波长的红色荧光探针，我们将其用于脑组织的标记。对TH和DBH或DBH和PNMT进行双重免疫标记是一种成功有效的方法。作者首先使用兔抗酪氨酸羟化酶多克隆抗体和抗多巴胺β-羟化酶，随后使用山羊抗兔IgG/Cy3二抗混合物和山羊抗小鼠IgG/ALexa Fluor 35030分钟，然后用探针(10 μM)染色120分钟。对于PNMT和DBH双标记实验，切片用兔抗PNMT多克隆抗体和抗多巴胺β-羟化酶2 h后，加入山羊抗兔IgG/Cy3二抗混合物(和山羊抗小鼠IgG/ALexa Fluor 350 30分钟，然后用探针(10 μM)染色120分钟。探针(b1, b2)和DBH-AF350 (c1,c2)的荧光发射区域有广泛的重叠(e1, e2)，表明探针对去甲肾上腺素能神经元具有特异性的标记能力。同时，通过DBH和PNMT的双重免疫标记，仍然显示探针特异性地标记去甲肾上腺素高于肾上腺素。这种双向检测策略有力地证明了探针能够在组织水平上有效地、特异性地标记去甲肾上腺素。
由于探针的波长较长，成像的穿透深度总是受到波长的限制，有效地补充了荧光成像的局限性，进行了活体荧光成像。在小鼠背部右侧注射探针(20μM)，然后注射去甲肾上腺素200μM)在同一区域注入。在小鼠背部另一侧注射20μM探针和与NE体积相同的PBS。信号NE组的红通道随时间增加而增加，而对照组则无明显变化。我们认为该探针可作为体内NE检测的有效工具，在神经递质和信号通路的定量分析方面具有良好的临床应用前景。
氟西汀作为一种选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂，可以增强5 -羟色胺的神经传递，产生与氟西汀一样的抗抑郁作用，它还可以增加下丘脑、皮质、皮质和前额叶皮质中的多巴胺和细胞外去甲肾上腺素水平，作者进行了氟西汀干预下去甲肾上腺素释放显像实验。我们给大鼠腹腔注射氟西汀(10mg/kg)，手术暴露大脑40min后，将探针(200μM)直接注入大脑成像。与老鼠同样体积的生理盐水腹腔内,老鼠用氟西汀治疗大脑中去甲肾上腺素水平明显高于对照组，为临床抗抑郁药物的筛选和疗效评估提供新的研究手段。
结论
作者采用离开保护荧光团基团产生分子内PET效应，没有荧光发射。随后，利用NE独特的氨基乙醇结构单元，通过级联亲核和离开反应，发生脱保护和荧光团释放。利用长波长红光荧光探针，我们通过细胞成像、切片成像和体内成像验证了探针在复杂生物环境中对NE的特异性响应。作者应用该探针对高K+刺激下去甲肾上腺素胞饮信号通路进行荧光成像，并观察到抗抑郁药物对去甲肾上腺素干预的效果。
参考文献
Specific Fluorescent Probe Based on “Protect−Deprotect” To Visualize theNorepinephrine Signaling Pathway and Drug Intervention Tracers. Na Zhou, Fangjun Huo, Yongkang Yue, and Caixia Yin*, J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 17751−17755. https://dx.doi.org/10.1021/jacs.0c08956
