内容提要
光声(PA)成像已经成为一种可靠的体内技术，用于从疾病筛选到分析传感的各种生物医学应用。大多数当代PA显像剂采用NIR-I光(650 - 900 nm)来产生超声信号，然而，内源性生物分子如血红蛋白会产生明显的干扰。向更长的激发波长(即NIR-II)过渡可以减少背景，促进低含量目标分子如NO)的检测。作者采用开发了一种NIR II NO-响应探针APNO-1080，可用于深层组织PA成像。首先，作者进行了Hammett和Brønsted分析，确定一种高度反应性和选择性的苯胺基接受器，通过N-硝化化学与NO反应。在原位乳腺癌模型和异位肺癌模型中评估了APNO-1080在体内的深层组织成像能力。
结果与讨论
通过具有不同取代位的苯胺（对位分别是−Br，−H，−CH2OH，−Et，−Me，−OEt和−OMe)与Cy7-Cl反应，获得探针1−7。相应的Hammett图显示ρ值为−0.94，这与在过渡态积累的适度正电荷特征一致，这是由增加的电子密度促进的。从的Brønsted图中观察到苯胺的共轭酸的pKa和反应的初始速率之间有很强的相关性(R2= 0.87)。探针7在不到30秒的时间内促进了NO的接近完全转化(25°C, 100等量)。作者将接收器连接在三个商用的NIR-II花菁(IR-26、IR-1061和IR-1048)以及Et-108032和FlavV7上合成了8−12个探针。该系列的每个化合物都有一个大的消光系数(约为105M−1cm−1)，在近红外II窗口中吸光度最大。但是，这并不是影响PA信号强度的唯一因素。探针8、9和12在缓冲溶液体系中都很难溶解，这导致了较弱的PA信号。探针10和11在水介质中具有清晰明确的光谱特性，并且在照射后具有明显更强的PA信号。当NO过量时， 10和11反应完全。探针10(APNO-1080)能快速转化为N-亚硝化产物，最大吸光度从874 nm转移到1080 nm，红移206 nm。APNO-1080及其N-亚硝化产物的连续辐照不会导致任何光氧化或光反硝化作用。作者首先检测了APNO-1080 NIR-II光声探针对NO的选择性。在任何情况下，作者都没有观察到任何不希望的探针激活。此外，作者进行了一个标准的MTTA549细胞在25 μM浓度下培养24小时无细胞毒性。将APNO-1080与富含CYP450酶的大鼠肝微粒体(RLM)在37°C孵育1 h，检测其代谢稳定性。APNO-1080在1080 nm处的吸光度没有增加，说明有RLM存在时APNO-1080是稳定的。
作者比较了APNO-1080和探针7(APNO-780)的深层组织能力。每个探针的溶液都用NO供体(MAHMA-NONOate)处理以确保完全激活。将得到的产品嵌入由琼脂糖和2%牛奶组成的3厘米厚的模拟组织中，在吸光度最大处成像。APNO-1080可以清晰地观测到，而APNO-780在背景中无法识别。当根据波长依赖性的影响差异进行校正时，相当于灵敏度增加了17.7倍。两个探针的PA强度相似，表明激发光的穿透增加是导致灵敏度差异的原因。这是一个近似效果，因为模拟的组织缺乏血红蛋白和氧血红蛋白，活体中减弱NIR-I光比NIR-II光更明显。
检测与癌症相关的内源性NO对于理解其在调节肿瘤微环境中的作用至关重要。APNO-1080首次应用于原位4T1-Luc乳腺癌模型。与作者之前皮下乳腺癌模型相比，由此产生的原位肿瘤可以生长到体内更深处，是评估APNO-1080在体内深层组织成像能力的理想模型。表达荧光素酶的细胞系用来确认植入和跟踪肿瘤生长。当肿瘤体积增长到约400mm3时，给药APNO-1080后对动物进行成像，并使用光谱分离来自探针的信号。作者观察到荷瘤小鼠的激活反应为1.3±0.1倍，而无肿瘤对照小鼠的激活反应为1.0±0.2倍。我们将A549-Luc2肺癌细胞移植到Nu/J小鼠的肝脏上，模拟肺癌患者的肝转移，并提供更深组织中成像NO的可能性。植入后几周使用生物发光成像检测肿瘤，然后通过眼球注射APNO-1080进行PA成像。30分钟后进行实时PA监控，观察到一个明显信号增加肿瘤区域。
结论
作者成功地开发了第一个NIR-II光声探针APNO-1080，用于检测深层组织中内源性癌症来源的NO。APNO-1080在NIR-II花菁平台(IR-1048)上具有优化的对甲氧基苯胺接受器。与NO反应后，N-亚硝化产物的消光系数在1080nm处吸收最大，与探针的光谱无重叠，能够灵敏地检测肿瘤中稳定浓度在低nM范围内的NO。本研究强调了将PA造影剂和光声探针移至NIR-II窗口以获得更大的成像深度和更高的灵敏度的价值。
参考文献
Developmentof NIR-II Photoacoustic Probes Tailored for Deep-Tissue Sensing of Nitric Oxide, Melissa Y. Lucero, Amanda K. East, Christopher J.Reinhardt, Adam C. Sedgwick, Shengzhang Su, Michael C. Lee, Jefferson Chan*, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 7196−7202， https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03004.
